Challenges in microbial production of succinic acid: extracellular matrix characterization and strain improvement strategies for enhanced yield

Abstract

Este trabalho teve como objetivo desenvolver estratégias para melhorar a produção microbiana de ácido succínico por Actinobacillus succinogenes e caracterizar a composição e propriedades do material polimérico extracelular (EPS) e biofilme produzidos por essa bactéria. A pesquisa foi conduzida em duas frentes principais: (i) a caracterização estrutural, físico-química e biológica do EPS e do biofilme gerados durante a fermentação, e (ii) o melhoramento da cepa por meio de Evolução Adaptativa Laboratorial (ALE) e mutagênese química com etilmetanossulfonato (EMS) para aumentar a tolerância ao ácido succínico. A caracterização do EPS foi realizada com o uso de técnicas de espectroscopia (FTIR, Raman), difração de raios-X, calorimetria diferencial de varredura (DSC), análise termogravimétrica (TGA), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e cromatografia (HPLC). Os resultados demonstraram que o EPS é um novo biopolímero composto majoritariamente por ácido succínico (44%) e manose (41%), com características similares aos succinoglicanos, mas especificidades como alto teor ácido succínico e manose e estrutura cristalina, os quais conferem maior resistência mecânica, estabilidade térmica e como sistemas de entrega em biomateriais interativos. A solução de EPS apresentou comportamento Newtoniano e baixa viscosidade (4 mPa s-1). As imagens de MEV revelaram uma matriz biofilme densa e fibrilar, com elevada concentração de células aderidas. Foi desenvolvida e validada uma metodologia de quantificação de biomassa aderida baseada na correlação entre o teor proteico do biofilme e a concentração celular, que indicou 2,03 ± 0,28 g de células por 100 g de biofilme seco, valor equivalente ao predito pela equação obtida a partir do teor de proteína (2,21 g/100 g). Essa abordagem permitiu contornar o gargalo de subestimação da biomassa total em processos de fermentação succínica e se apresenta como uma ferramenta alternativa para avaliação da biomassa imobilizada. Na segunda etapa, a aplicação de ALE e mutagênese química gerou mutantes com maior velocidade específica de crescimento e tolerância ao ácido succínico em comparação à cepa parental. Entre os mutantes obtidos, a cepa LMQ2.5 apresentou o melhor desempenho, com aumento de 3,6 vezes na produção de ácido succínico sob estresse ácido, maior eficiência de conversão e redução de cerca de quatro vezes na formação de biofilme, o que favorece a recuperação do produto e simplifica o processo downstream. Os resultados obtidos neste estudo preencheram lacunas científicas e tecnológicas relevantes relacionadas à fermentação succínica por A. succinogenes, incluindo a caracterização inédita do exopolissacarídeo produzido pela bactéria, contribuindo para a compreensão estrutural e funcional da matriz extracelular e do biofilme formados durante a fermentação. A metodologia de quantificação de células aderidas desenvolvida permitiu estimar de forma precisa a biomassa imobilizada, corrigindo distorções na avaliação do processo. Além disso, o aprimoramento da cepa por ALE e mutagênese química resultou em um mutante com elevada tolerância ao ácido succínico, maior eficiência fermentativa e menor formação de biofilme, demonstrando a viabilidade de estratégias evolutivas não transgênicas para otimização de cepas industriais. Em conjunto, esses avanços oferecem bases experimentais e metodológicas para o aprimoramento de bioprocessos de produção de ácido succínico e para a exploração de novos biopolímeros microbianos de interesse tecnológico.

Abstract: This study aimed to develop strategies to improve the microbial production of succinic acid by Actinobacillus succinogenes and to characterize the composition and properties of the extracellular polymeric substance (EPS) and biofilm produced by this bacterium. The research was conducted in two main approaches: (i) the structural and physicochemical characterization of the EPS and biofilm generated during fermentation, and (ii) strain improvement through Adaptive Laboratory Evolution (ALE) and chemical mutagenesis using EMS to increase tolerance to succinic acid. Characterization of the extracellular material was performed using spectroscopic techniques (FTIR, Raman), X-ray diffraction (XRD), differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy (SEM), and chromatography (HPLC). The results demonstrated that the EPS is a novel biopolymer composed mainly of succinic acid (44%) and mannose (41%), exhibiting similarities to succinoglycans but with unique characteristics such as a high acid content and crystalline structure. The aqueous EPS solution showed Newtonian behavior and low viscosity (4 mPa·s?¹), as well as good thermal stability. SEM images revealed a dense and fibrillar biofilm matrix with a high amount of adhered cells. A methodology was developed and validated to quantify adhered biomass based on the correlation between the protein content of the biofilm and the cell concentration, indicating 2.03 ± 0.28 g of cells per 100 g of dry biofilm ? a value equivalent to that predicted by the protein-based equation (2.21 g/100 g). This approach confirmed the underestimation of total biomass in conventional fermentation analyses and provides an alternative tool for assessing immobilized biomass in biofilm-forming systems. In the second part of the study, the application of ALE and chemical mutagenesis generated mutants with higher specific growth rates and greater tolerance to succinic acid compared with the parental strain. Among the obtained mutants, strain LMQ2.5 exhibited the best performance, with a 3.6-fold increase in succinic acid production under acid stress, higher conversion efficiency, and approximately fourfold reduction in biofilm formation, favoring product recovery and simplifying downstream processing. The results of this study addressed key scientific and technological gaps related to the physiology and behavior of A. succinogenes in fermentative systems. The first-time characterization of the exopolysaccharide secreted by this bacterium revealed a new succinic and mannose-rich biopolymer, contributing to the understanding of the structural and functional composition of the extracellular matrix and biofilm formed during fermentation. The developed methodology for quantifying adhered cells enabled accurate estimation of immobilized biomass, correcting kinetic evaluation distortions and strengthening growth analyses in biofilm systems. Furthermore, strain improvement by ALE and EMS mutagenesis resulted in a mutant with high succinic acid tolerance, enhanced fermentation performance, and reduced biofilm formation, demonstrating the feasibility of non-recombinant evolutionary strategies for industrial strain optimization. Together, these advances provide experimental and methodological foundations for the improvement of succinic acid bioprocesses and the exploration of new microbial biopolymers of technological relevance.