Anthocyanin recovery from black rice bran using alternative technologies and improving stability through enzymatic acylation

Abstract

Durante todo o ciclo de vida dos alimentos, algumas partes dos produtos podem ser desperdiçadas, gerando resíduos ou subprodutos. Cerca de 20% da casca, 10% do farelo e 14% do arroz quebrado são produzidos durante o processamento do arroz negro (ou arroz preto). Moléculas de valor agregado podem ser obtidas de subprodutos alimentares do arroz negro, principalmente as antocianinas. Relatos desses compostos com efeitos antiobesidade, antidiabéticos, antimicrobianos, anticancerígenos, neuroprotetores e em doenças cardiovasculares foram apresentados. A extração de antocianinas pode ser uma alternativa viável para o reaproveitamento do material gerado durante o beneficiamento do arroz negro, principalmente utilizando técnicas alternativas, como extração por líquido pressurizado (PLE), extração assistida por ultrassom (UAE) e extração assistida por micro-ondas (MAE). No entanto, esses compostos são susceptíveis a condições notáveis de processamento de luz, temperatura e oxigênio. A acilação (esterificação de um ácido orgânico ao glicosídeo da molécula de antocianina) pode ser uma abordagem para melhorar a estabilização desses compostos. A acilação enzimática tem alta regiosseletividade e reações moderadas, sendo considerado o método preferido para a produção de derivados flavonoides acilados. Dessa forma, este trabalho propõe investigar a recuperação de antocianinas de farelo de arroz negro usando tecnologias emergentes (PLE, UAE e MAE) e posterior acilação enzimática de antocianinas recuperadas para melhorar a estabilidade desses compostos. Foram realizadas análises de termoestabilidade, citoxicidade e medidas da sustentabilidade através das métricas verdes: Certificado Verde e EscalaEco. Além disso, para os compostos purificados e acilados, foi realizada a análise de transporte epitelial utilizando cocultura Caco2:HT29-MTX. Todos os métodos alternativos de extração quando otimizados apresentaram recuperação de antocianinas superior a 80%, não tendo diferença significativa entre si (p<0.05). Entretanto, o extrato obtido por UAE foi o que apresentou maior quantidade de cianidina-3-glicosídeo (C3G), identificado por HPLC. Nenhum dos extratos apresentou citoxicidade (500 µg/mL) para as células L929 e todos apresentaram efeito citoprotetor quando submetido ao estresse oxidativo com H2O2. Todas as técnicas foram consideradas ecologicamente verdes pelo Certificado Verde (A) e métodos excelentes pela EcoScale (pontuações maiores que 75), destacando-se o extrato obtido por UAE. Para a acilação enzimática, foi considerado o método por UAE para dar continuidade ao trabalho devido ao seu maior teor de C3G e melhores resultados obtidos pelo Certificado Verde e EcoScale. Foi possível obter cerca de 53% da formação do produto acilado com ácido octanóico (C3G-C8), ao utilizar acetonitrila:DMSO (10:1), temperatura de 60 °C e 15 g/L de enzima lipase CalB. Além disso, foi observado que o composto acilado apresentou maior termoestabilidade que o purificado (C3G), sendo verificado pelos maiores valores de tempo de meia-vida para os pHs 3, 5 e 7. Ambos compostos não apresentaram citoxicidade e apresentaram cerca de 1,2% de transporte epitelial em cocultura com Caco2:HT29-MTX, não diferenciando entre si (p<0.05). Portanto, o extrato do farelo do arroz negro tem grande potencial para aplicação como ingrediente em alimentos funcionais, suplementos ou formulações farmacológicas. A acilação enzimática de antocianinas demonstrou-se uma técnica promissora para aumento da sua termoestabilidade e lipoficilidade, permitindo a aplicação em produtos de matrizes lipídicas.

Abstract: Some parts of the products may be wasted throughout the food life cycle, generating residues or by-products. Approximately 20% of the husk, 10% of the bran, and 14% of the broken rice are produced during the processing of black rice. Value-added molecules can be obtained from black rice food by-products, mainly anthocyanins. Reports of these compounds with anti-obesity, anti-diabetic, antimicrobial, anti-cancer, neuroprotective, and cardiovascular disease effects have been presented. Anthocyanin extraction may be a viable alternative for the reuse of the material generated during the processing of black rice, mainly using alternative techniques, such as pressurized liquid extraction (PLE), ultrasound-assisted extraction (UAE), and microwave-assisted extraction (MAE). However, these compounds are susceptible to notable light, temperature, and oxygen processing conditions. Acylation (esterification of an organic acid to the glycoside of the anthocyanin molecule) may be an approach to improve the stabilization of these compounds. Enzymatic acylation has high regioselectivity and moderate reactions and is the preferred method for producing acylated flavonoid derivatives. Therefore, this project proposes to investigate the recovery of anthocyanins from black rice bran using emerging technologies (PLE, UAE, and MAE) and subsequent enzymatic acylation of recovered anthocyanins to improve the stability of these compounds. Thermostability, cytotoxicity, and sustainability measures were analyzed through Green Certificate and EscalaEco green metrics. In addition, epithelial transport analysis was performed using Caco2:HT29-MTX coculture for the purified and acylated compounds. All emerging extraction methods, when optimized, showed anthocyanin recovery greater than 80%, with no significant difference between them (p<0.05). However, the extract obtained by UAE presented the highest amount of cyanidin-3-glucoside (C3G) identified by HPLC. None of the extracts presented cytotoxicity (500 µg/mL) for L929 cells, and all presented cytoprotective effects when subjected to oxidative stress with H2O2. All techniques were considered ecologically green by the Green Certificate (A) and excellent methods by EcoScale (scores higher than 75), highlighting the extract obtained by UAE. The UAE method was considered to continue the work with enzymatic acylation due to its higher C3G content and better results obtained by the Green Certificate and EcoScale. It was possible to obtain approximately 53% of the formation of the product acylated with octanoic acid (C3G-C8) when using acetonitrile:DMSO (10:1), temperature of 60 °C and 15 g/L of lipase enzyme CalB. Furthermore, it was observed that the acylated compound presented greater thermostability than the purified one (C3G), as verified by the higher half-life values for pHs 3, 5, and 7. Both compounds did not present cytotoxicity and presented approximately 1.2% epithelial transport in coculture with Caco2:HT29-MTX, not differentiating between them (p<0.05). Therefore, black rice bran extract has great potential for application in functional foods, supplements, or pharmacological formulations. The enzymatic acylation of anthocyanins proved a promising technique for increasing their thermostability and lipophilicity, allowing the application in lipid matrix products.