Comparação dos métodos PMA-qPCR e contagem em placas para modelagem preditiva do crescimento de bactérias ácido-lácticas, Salmonella enterica e suas interações em presunto de peru defumado

Abstract

Este estudo comparou os métodos quantitative Polymerase Chain Reaction com moniazida de propídio (PMA-qPCR) e contagem em placa (CP), combinados com modelagem preditiva, para descrever o crescimento e as interações das bactérias ácido-lácticas (BAL), Leuconostoc mesenteroides e Weissella viridescens, e de três diferentes sorotipos de Salmonella enterica (Heidelberg, Typhimurium e Enteritidis) em presunto de peru defumado, fatiado e embalado a vácuo (PPF), sob diferentes temperaturas de armazenamento (8, 10, 12, 16 e 20 °C) em monocultivo e co-cultivo. Inicialmente, curvas padrão foram desenvolvidas para os ensaios de PMA-qPCR, demonstrando alta eficiência e sensibilidade, com limites de quantificação entre 1 e 2 log10 UFC/g para todas as espécies, em todas as temperaturas. Essas curvas foram usadas para quantificar a cinética de crescimento das BAL e S. enterica pelo método PMA-qPCR, que foi comparado ao método CP. Os resultados mostraram boa correlação entre os métodos para quantificação das três espécies em monocultivo. No entanto, os gráficos de Bland-Altman indicaram que o método CP subestimou o crescimento de W. viridescens a 8 °C e de S. enterica em todas as temperaturas, sugerindo a presença de células estressadas ou viáveis, mas não cultiváveis (VBNC), detectáveis por PMA-qPCR, mas não por CP. Esse estresse não foi observado para L. mesenteroides. Subsequentemente, o modelo de Baranyi e Roberts, assim como os modelos secundários (exponencial e raiz quadrada de Ratkowsky), apresentaram bons índices estatísticos e foram adequados para descrever as curvas de crescimento de L. mesenteroides, W. viridescens e S. enterica em PPF obtidas por ambos os métodos em monocultivo. Para estudar a interação entre S. enterica, L. mesenteroides e W. viridescens em co-cultivo, foram utilizadas duas abordagens distintas. Na primeira, o método CP quantificou o crescimento de S. enterica e a contagem total de BAL (CTB), sem diferenciar L. mesenteroides e W. viridescens, considerando a CTB como uma única bactéria representada pelos dados de L. mesenteroides em monocultivo. Na segunda, o método PMA-qPCR quantificou as três espécies em co-cultivo, utilizando as curvas padrão de monocultivo. O modelo de efeito Jameson modificado, incluindo o fator de interação ?, descreveu adequadamente a interação entre L. mesenteroides e S. enterica. Observou-se a inibição de S. enterica a 8 °C e 10 °C, enquanto a 12 °C, 16 °C e 20 °C, seu crescimento foi interrompido ou significativamente reduzido quando L. mesenteroides atingiu sua população máxima. O modelo de interação de três espécies, baseado no efeito Jameson, descreveu bem a interação entre as três bactérias, com RMSE variando de 0,1108 a 0,1948 para S. enterica, de 0,0934 a 0,2510 para W. viridescens, e de 0,1518 a 0,2823 para L. mesenteroides. Em conclusão, os resultados mostraram que o método PMA-qPCR pode descrever a cinética de crescimento microbiano de BAL e S. enterica em monocultivo e co-cultivo sob diferentes condições isotérmicas, permitindo quantificar células VBNC e diferenciar espécies morfologicamente semelhantes. Este estudo contribui para o avanço no uso de métodos moleculares e modelos preditivos na avaliação da vida útil e segurança de produtos cárneos prontos para consumo, como presunto de peru defumado.

Abstract: This study compared the quantitative Polymerase Chain Reaction with propidium monoazide (PMA-qPCR) and plate count (PC) methods, combined with predictive modeling, to describe the growth and interactions of lactic acid bacteria (LAB), Leuconostoc mesenteroides and Weissella viridescens, and three different serotypes of Salmonella enterica (Heidelberg, Typhimurium, and Enteritidis) in sliced, vacuum-packaged, smoked turkey ham (STH) under different storage temperatures (8, 10, 12, 16, and 20 °C) in monoculture and co-culture. Initially, standard curves were developed for PMA-qPCR assays, demonstrating high efficiency and sensitivity, with quantification limits between 1 and 2 log10 CFU/g for all species at all temperatures. These curves were used to quantify the growth kinetics of LAB and S. enterica by the PMA-qPCR method, which was compared to the PC method. The results showed a good correlation between the methods for the quantification of the three species in monoculture. However, Bland-Altman plots indicated that the PC method underestimated the growth of W. viridescens at 8 °C and S. enterica at all temperatures, suggesting the presence of stressed or viable but non-culturable (VBNC) cells, detectable by PMA-qPCR but not by PC. This stress was not observed for L. mesenteroides. Subsequently, the Baranyi and Roberts model, as well as the secondary models (exponential and Ratkowsky square root), presented good statistical indices and were adequate to describe the growth curves of L. mesenteroides, W. viridescens, and S. enterica in STH obtained by both methods in monoculture. To study the interaction between S. enterica, L. mesenteroides, and W. viridescens in co-culture, two distinct approaches were used. In the first, the PC method quantified the growth of S. enterica and the total count of LAB, without differentiating L. mesenteroides and W. viridescens, considering total count of LAB as a single bacterium represented by the data of L. mesenteroides in monoculture. In the second, the PMA-qPCR method quantified the three species in co-culture, using the standard curves of monoculture. The modified Jameson effect model, including the interaction factor ?, adequately described the interaction between L. mesenteroides and S. enterica. Inhibition of S. enterica was observed at 8 °C and 10 °C, while at 12 °C, 16 °C, and 20 °C, its growth was interrupted or significantly reduced when L. mesenteroides reached its maximum population. The three-species interaction model, based on the Jameson effect, described the interaction between the three bacteria studied well, with RMSE ranging from 0.1108 to 0.1948 for S. enterica, from 0.0934 to 0.2510 for W. viridescens, and from 0.1518 to 0.2823 for L. mesenteroides. In conclusion, the results showed that the PMA-qPCR method can describe the microbial growth kinetics of LAB and S. enterica in monoculture and co-culture under different isothermal conditions, allowing the quantification of VBNC cells and differentiation of morphologically similar species. This study contributes to the advancement in the use of molecular methods and predictive models in the assessment of the shelf life and safety of ready-to-eat meat products, such as smoked turkey ham.