Produção, purificação e avaliação da citotoxicidade e atividade hemolítica do benzoato de benzila obtido por acilação mediada por Lipozyme® TL IM

Abstract

O emprego da biotecnologia na síntese de ésteres aromáticos vem ganhando espaço na indústria devido ao uso de condições amenas no processo de produção, utilização de catalisadores biodegradáveis, dentre outros, proporcionando a fabricação de produtos classificados como naturais e sustentáveis. Esta pesquisa teve por objetivo a síntese de benzoato de benzila por acilação enzimática em modo batelada, utilizando a lipase comercial imobilizada Lipozyme TL IM como biocatalisador para, posteriormente, avaliar a purificação do éster produzido e determinar sua atividade biológica (viabilidade celular e teste de hemólise). Atualmente, este composto é produzido por rota química, na qual utilizam-se altas temperaturas e ácidos como catalisadores. As lipases podem ser utilizadas como catalisadores para os processos de esterificação e acilação e, quando utilizadas na sua forma imobilizada, reduzem a geração de resíduos, garantindo um processo mais ?limpo?. Neste trabalho foi avaliada a síntese do éster benzoato de benzila utilizando anidrido benzoico como doador de grupo acila, presença em excesso de álcool benzílico, agitação de 100 rpm, regime de operação em batelada e ausência de solventes. Um planejamento experimental foi realizado para maximização da conversão, levando à condição maximizada como sendo: 8% de Lipozyme TL IM (m/m), 60 °C e razão molar de 1:3 (anidrido benzoico: álcool benzílico), resultando em um sistema reacional de 5,8 g, garantindo 75% de conversão em 8 h. Na avaliação cinética do processo, a maior conversão de 93,3% foi encontrada no tempo de 24 h. Um estudo de reutilização do catalisador foi realizado e dentre os solventes testados para recuperar a Lipozyme TL IM no teste de reciclo, o acetato de etila foi o solvente mais adequado. O primeiro ciclo de reuso enzimático levou à uma conversão de ~63% (houve redução da conversão em comparação ao estudo da cinética devido à redução da atividade da enzima - de 50,2 para 15,5 U/g), seguida de ~38% e ~39% nos 2º e 3º ciclos, respectivamente. Na avaliação do aumento de escala (20 vezes maior em relação ao estudo prévio), os resultados encontrados para a atividade enzimática e para a conversão em benzoato de benzila foram similares ao do primeiro ciclo de reuso, sendo eles ~17 U/g e ~66%, respectivamente, confirmando a reprodutibilidade e a possibilidade de produção em larga escala. Por fim, a metodologia utilizada para purificação do éster (extração líquido-líquido seguida de destilação a vácuo) se mostrou eficaz, atingindo uma pureza de 96,7% de benzoato de benzila e rendimento de 2,11%. A partir do estudo preliminar da atividade biológica deste éster, pôde-se observar que não houve dano nos eritrócitos humanos e nem citotoxicidade nas concentrações de 1 e 2% de benzoato de benzila, ou seja, nessas concentrações este éster pode ser considerado seguro para aplicações na biomedicina.

Abstract: The use of biotechnology in the synthesis of aromatic esters has been gaining ground in the industry due to the use of mild conditions in the production process, the use of biodegradable catalysts, among others, providing the manufacture of products classified as natural and sustainable. This research aimed at the synthesis of benzyl benzoate by enzymatic acylation in batch mode, using the immobilized commercial lipase Lipozyme TL IM as a biocatalyst. Subsequently, purify the product (benzyl benzoate) and determine its biological activity (antimicrobial, cell viability, and hemolysis test), aiming at a possible scale-up. This compound is produced by a chemical route, in which acids are used as catalysts in high temperatures. Lipases can be used as catalysts for esterification and acylation processes, and when immobilized, reduce waste generation, ensuring a ?cleaner? process. In this work, the synthesis of benzyl benzoate ester was evaluated using benzoic anhydride as acyl group donor, presence in excess of benzyl alcohol, stirring at 100 rpm, batch operation, and absence of solvents. An experimental design was carried out to maximize the conversion, leading to the maximized condition as 8% Lipozyme TL IM (m/m), 60 °C, and 1:3 molar ratio (benzoic anhydride: benzyl alcohol), resulting in a 5.8 g reaction system, guaranteeing 75% conversion in 8 h. In the kinetic evaluation of the process, the highest conversion (93.3%) was found at 24 h. A catalyst reuse study was employed, and among the solvents tested to wash Lipozyme TL IM in the recycle test, ethyl acetate was the most suitable solvent. The first cycle of enzymatic reuse led to a conversion of ~63% (there was a reduction in conversion compared to the kinetics study due to the loss of enzyme activity - from 50.2 U/g to 15.5 U/g), followed by ~38 % and ~39% in the 2nd and 3rd cycles, respectively. In the evaluation of the scale increase (20 times greater than the previous study), the results found for the enzymatic activity and the conversion to benzyl benzoate were similar to those of the first reuse cycle, being ~17 U/g and ~66 %, respectively, confirming the reproducibility and the possibility of large-scale production. Finally, the methodology used for ester purification (liquid-liquid extraction followed by vacuum distillation) was effective, reaching a purity of 96.7% benzyl benzoate and a yield of 2.11%. From the preliminary study of the biological activity of this ester, it was observed that there was no damage to human erythrocytes and no cytotoxicity at concentrations of 1 and 2% of benzyl benzoate, that is, at these concentrations this ester can be considered safe for applications in biomedicine.