Obtenção de extratos bioativos de folhas de casearia sylvestris e encapsulamento em biopolímero utilizando a tecnologia supercrítica

Abstract

Casearia sylvestris, também conhecida como guaçatonga, é uma planta medicinal nativa do Brasil, Peru, Argentina, Uruguai e Bolívia. Na medicina popular suas folhas são utilizadas como anestésico tópico, antisséptico, agente antitumoral, antiulcerativo e cicatrizante. Nos extratos de Casearia existem substâncias de grande interesse como cumarinas, flavonóides e diterpenos, especialmente diterpenos clerodânicos como as casearinas e casearvestrinas, as quais são compostos bioativos que apresentam excelente potencial citotóxico e antitumoral. A extração supercrítica (ESC) possuiu aplicações em uma grande variedade de processos, devido à possibilidade de serem obtidos extratos livres de solventes e ao uso de baixas temperaturas de extração, além de ser um processo seletivo na obtenção de compostos bioativos. Considerando a importância dos componentes bioativos, o conhecimento do equilíbrio de fases de extratos naturais em meio supercrítico é fundamental para a determinação das condições ótimas para processos de separação, precipitação e encapsulamento realizados em altas pressões. Assim, o objetivo do presente trabalho foi obter extratos de C. sylvestris empregando a extração supercrítica (ESC), com CO2 puro e com cossolvente, e as técnicas à baixa pressão Soxhlet (SOX) e maceração (MAC) com diferentes solventes orgânicos, com a finalidade de comparar os rendimentos dos diferentes processos, a composição química e atividade biológica dos extratos. As extrações à baixa pressão foram realizadas com hexano (HX), diclorometano (DCM), acetato de etila (ETOAC), etanol (ETOH) e clorofórmio (CLF). Além disso, também foi estudado o comportamento do equilíbrio de fases de sistemas compostos por extratos de C. sylvestris, solvente orgânico, polímero e CO2 supercrítico para a aplicação processos de precipitação/encapsulamento pela técnica antissolvente supercrítico (SAS). Os extratos de ESC de C. sylvestris foram obtidos em pressões de 100 a 300 bar, temperaturas de 40 oC a 60 oC com fluxo de CO2 de 8 ± 2 g/min, durante 3,5 h. Os rendimentos de ESC alcançaram valores de até 5,8 ± 0,6 % (m/m) para extração com CO2 puro e 8,2 ± 0,1 % (m/m) quando foi adicionado 8 % de etanol como cossolvente na condição de extração a 200 bar/50 oC. As extrações a baixa pressão com melhor rendimento foram SOX com ETOH e ETOAC, alcançando rendimentos de 23 ± 1 % (m/m) e 8 ± 1 % (m/m), respectivamente. Além do rendimento de extração, as técnicas foram também comparadas pelo teor de fenólicos total (TFT), apresentando valores máximos de 169,4 ± 0,6 mg EAG/g (SOX-ETOH) e 135 ±4 mg EAG/g (MAC-ETOH). Pelo método DPPH, o potencial antioxidante obtido apresentou valores de concentração efetiva a 50 % (CE50) de 245 ± 4 µg/mL (ESC 300 bar/50 °C + 8 % ETOH) e 239,7 ± 0,3 µg/mL (MAC- ETOAC), enquanto que os melhores valores obtidos pelo método do ß-caroteno/ácido linoleico foram de 110 ± 1 % para o extrato de ESC a 200 bar/50 ºC + 2 % ETOAC e 111 ± 3 %, para SOX-ETOAC após 120 minutos de reação. Para o método ABTS, os melhores resultados foram obtidos para SOX-ETOH (573 ± 7 µM ET/g) e MAC-ETOH (442 ± 4 µM ET/g). Nos ensaios in vivo, os extratos ESC 300 bar/50 oC + 5 % ETOAC e ESC 300 bar/50 oC + 5 % ETOH apresentaram as melhores reduções de ganho de peso. A maior redução dos níveis de colesterol foi obtida para as condições SOX-ETOH e SOX-ETOAC e para a redução dos triglicerídios foi obtida para SOX-ETOAC e também para ESC 300 bar/50 oC + 5 % ETOH. A redução dos níveis de glicose apresentou os melhores resultados para as condições de ESC 300 bar/50 oC e 300 bar/50 oC + 5 % ETOH. No perfil químico dos extratos por cromatrografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), foram identificados compostos terpênicos importantes como (-)-espatulenol, (+)-espatulenol, fitol, a-cariofileno/a-humuleno, ß-cariofileno; ß-sitosterol, ?-elemeno e vitamina E. A determinação do equilíbrio de fases de sistemas contendo extratos de C. sylvestris foi de fundamental importância para a obtenção das condições de temperatura e pressão para o processo de precipitação SAS aplicadas nesse trabalho. Em todas as condições aplicadas, foram obtidas partículas encapsuladas (extrato de C. sylvestris + Pluronic F127) com estimativa de tamanho na faixa micrométrica, variando de 102 ± 8 µm a 697 ± 230 µm, exceto para a condição de precipitação a 80 bar e 45 oC, onde foi obtido apenas uma mistura de compostos segregados.<br>

Abstract : Casearia sylvestris, also known as guaçatonga, is a native medicinal plant in Brazil, Peru, Argentina, Uruguay and Bolivia. The leaves of the plant are popularly used in folk medicine as topical anaesthetic, antiseptic, antitumor and antiulcer agents, and to heal skin wound diseases. In the Casearia extracts there are substances of great interest, such as coumarins, flavonoids and diterpenes, especially clerodane diterpenes as casearins and casearvestrins, which are bioactive with excellent cytotoxic and antitumor potential. Supercritical fluid extraction (SFE) is an alternative process to conventional extractions in various applications due to the possibility to obtain solvent-free extracts and the use of low extraction temperatures, warranting the process selectivity towards the bioactive compounds. Considering the importance of these compounds the knowledge of the phase equilibrium of natural extracts in supercritical fluids, obtained by experimental measurements, is fundamental for determination of optimal conditions for separation and precipitation processes conducted at higher pressures. In this way, this study aimed to obtain C. sylvestris extract using the supercritical fluid extraction (SFE) with pure CO2 and with co-solvent, in order to compare with extracts obtained from low pressure techniques Soxhlet (SOX) and maceration (MAC), with different organic solvents, in terms of yield process, composition and biological activity of the extracts. Low pressure extractions were performed with hexane (HX), dichloromethane (DCM), ethyl acetate (ETOAC), ethanol (ETOH) and chloroform (CLF). Also, the investigation of the phase equilibrium behavior of systems composed by C. sylvestris extract, organic solvent, polymer and supercritical CO2 was held by means of the static method to afford information for the separation and precipitation/encapsulation processes by the supercritical anti-solvent (SAS) technique. The SFE extracts from C. sylvestris were obtained at pressures from 100 to 300 bar, temperatures of 40 ºC to 60 oC with CO2 flow rate of 8 ± 2 g/min during 3.5 h. The SFE yields reached values up to 5.8 ± 0.6 % (w/w) for extraction with pure CO2 and 8.2 ± 0.1 % (w/w) when 8 % of ethanol as co-solvent was added to the extraction at 200 bar/50 oC. SOX extractions with ETOH and ETOAC obtained yields of 23 ± 1 % (w/w) and 8 ± 1 % (w/w), respectively. Also, the techniques efficiency was compared in terms of antioxidant capacity, evaluated by total phenolic content (TPC), presenting maximum values of 169.4 ± 0.6 mg GAE/g (SOX-ETOH) and 135 ± 4 mg GAE/g (MAC-ETOH). The antioxidant potential by DPPH assay resulted in effective concentration at 50 % (EC50) values of 245 ±4 µg/mL (SFE 300 bar/50 ºC + 8 % ETOH) and 239,7 ± 0,3 µg/mL (MAC- ETOAC), while the best values obtained by -carotene bleaching method were 110 ± 1 % obtained at 200 bar/50 ºC + 2 % ETOAC extract and 111 ± 3 % obtained by SOX-ETOAC after 120 minutes-reaction. The antioxidant evaluation by ABTS method the best results were presented by SOX-ETOH (573 ± 7 µM TE/g) and MAC-ETOH (442 ± 4 µM TE/g). In the in vivo experiments, the SFE extracts obtained at 300 bar/50 oC + 5 % ETOAC and ESC 300 bar/50 oC + 5 % ETOH presented the higher weight gain reductions. The higher reduction in the cholesterol levels were achieved at SOX-ETOH and SOX-ETOAC and for triglycerides reduction were obtained at SOX-ETOAC and SFE 300 bar/50 oC + 5 % ETOH. The glycose reduction presented the best results for SFE 300 bar/50 oC e 300 bar/50oC + 5 % ETOH conditions. The achievement of the extracts chemical profile by gas chromatography coupled to mass spectrometry analysis (GC-MS), were identified important terpenes as (-)-spathulenol, (+)- spathulenol, phytol, -caryophillene/-humulene, -caryophyillene; - sitosterol, -elemene and vitamin E. The investigation of the phase equilibrium behavior of systems composed by C. sylvestris extract was fundamental for the obtention of process temperature and pressure conditions for the SAS precipitation technique applied in this research. At all conditions performed, co-precipitated particles (C. sylvestris extract + Pluronic F127) were achieved with particle estimated size in the micrometric range, varying from 102 ± 8 µm to 697 ± 230 µm, except for the condition of precipitation at 80 bar and 45 oC, in which was only obtained a mixture of segregated compounds.