Detecção por PCR e qPCR de patógeno oportunista de origem alimentar Cronobacter sakazakii em alimentos infantis inoculados

Abstract

Cronobacter sakazakii é um patógeno oportunista emergente de origem alimentar, preocupante pela sua alta resistência a secagem, e associação a doenças graves e potencialmente fatais em recém-nascidos. Ao longo dos anos a fórmula infantil em pó vêm sendo reconhecida como possível fonte de transmissão do patógeno Cronobacter sakazakii, entretanto outros alimentos, como cereais infantis também podem se tornar um veículo de transmissão. Este trabalho tem como objetivo determinar as condições de PCR e qPCR para detecção de Cronobacter e avaliar a presença de C. sakazakii por PCR e qPCR em fórmula infantil e em mingau à base de milho inoculados com o patógeno. Estes alimentos inoculados com Cronobacter sakazakii foram mantidos a distintas temperaturas (4, 25 e 37°C) por 24 e 48 h. A análise de PCR obtive um limite de detecção de 5 log cópias de DNA/reação. Não foi detectado o produto da PCR em todas as amostras controles (não inoculadas), e nas amostras inoculadas logo após a inoculação (tempo zero) com Cronobacter a 3 log UFC/mL, nas amostras inoculadas e armazenadas a 4°C em ambos os alimentos, assim como não foi detectado nas amostras de mingau inoculadas e mantidas a 25°C por 24 horas. Porém o produto da PCR foi detectado nas amostras inoculadas mantidas a 25°C no período de incubação de 48 horas e a 37°C nos períodos de incubação de 24 e 48 horas. E em relação a fórmula infantil, a presença de Cronobacter por PCR foi detectada nas amostras inoculadas após 24 e 48 horas de incubação a 25°C e 37°C. Em relação a análise de qPCR, o limite de detecção foi de 2 log cópias de DNA/reação, e distintos limites de detecção para as amostras, sendo 4 log cópias DNA/mL de fórmula infantil e 5 log cópias DNA/mL de mingau a base de milho. Após incubação a 4°C, as amostras inoculadas de fórmula infantil apresentaram contagens de 3,97, 3,76 e 4,05 log número de cópias DNA/mL em 0, 24 e 48 horas, respectivamente. No mingau não houve detecção da amplificação do fragmento alvo por qPCR. Após incubação a 25°C, as amostras inoculadas de fórmula infantil apresentaram contagens de 7,66 e 7,81 log número de cópias/mL em 24 e 48 horas, respectivamente. Para as amostras inoculadas e mantidas a 25°C de mingau, as contagens foram 7,01 e 7,55 log número de cópias DNA/mL após 24 e 48 horas. Após incubação a 37°C, as amostras inoculadas de fórmula infantil apresentaram contagens de 6,09 e 7,75 log número de cópias DNA/mL em 24 e 48 horas, respectivamente. Para as amostras de mingau inoculadas e mantidas a 37°C, as contagens foram de 8,58 e 8,09 log número de cópias DNA/mL em 24 e 48 horas. s. As condições otimizadas deste estudo mostraram-se eficazes na detecção do patógeno, principalmente a análise de qPCR. A detecção de Cronobacter em alimentos infantis é extremamente importante para proteger os indivíduos vulneráveis, como os recém-nascidos, contra potenciais riscos microbiológicos.

Cronobacter sakazakii is an emerging opportunistic foodborne pathogen that raises significant concern due to its high resistance to drying and its association with severe and potentially fatal diseases in newborns. Over the years, powdered infant formula has been recognized as a possible source of Cronobacter sakazakii transmission; however, other foods such as infant cereals may also serve as a transmission vehicle. This study aims to determine PCR and qPCR conditions for Cronobacter detection and to evaluate the presence of C. sakazakii by PCR and qPCR in infant formula and corn-based porridge inoculated with the pathogen. These matrices inoculated with Cronobacter sakazakii were kept at different temperatures (4, 25, and 37°C) for 24 and 48 hours. The Cronobacter PCR analysis a detection limit of 5 Log DNA copy/reaction. PCR product was not detected in all control samples. No PCR product was detected at time zero after inoculation (Cronobacter 3 CFU/mL) and in all inoculated samples kept at 4°C, neither in porridge samples kept at 25°C for 24 hours. However, PCR was positive for inoculated samples kept at 25°C for 48 hours and at 37°C for 24 and 48 hours. Regarding infant formula inoculated samples, the presence of Cronobacter was detected at 25°C and 37°C after 24 and 48 hours of incubation. For qPCR analysis, the results achieved a detection limit of 2 log DNA copy/reaction, with different detection limits for the samples: 4 log DNA copy number/mL in infant formula and 5 log DNA copy number/mL in corn-based porridge. At 4°C, the infant formula samples showed counts of 3.97, 3.76, and 4.05 log DNA copy number/mL at 0, 24, and 48 hours, respectively. In corn porridge inoculated samples, no target fragment was detected. The infant formula samples kept at 25°C showed counts of 7.66, and 7.81 log DNA copy number/mL after 24 and 48 hours, respectively. The corn porridge samples counts were 7.01 and 7.55 log DNA copy number/mL after 24 and 48 hours. The infant formula inoculated samples kept at 37°C showed counts of 6.09 and 7.75 log DNA copy number /mL after 24 and 48 hours, respectively. In corn porridge inoculated samples kept at 37°C, the counts were 8.58 and 8.09 log DNA copy number /mL after 24 and 48 hours. The optimized conditions of this study have proven effective in Cronobacter detection, particularly the qPCR analysis. The detection of Cronobacter in infant foods is extremely important to protect vulnerable individuals, such as newborns