Análise computacional de possíveis sítios ativos extracelulares no canal de potássio BK: comparação entre o ligante sintético ctibd e a guanosina

Abstract

A guanosina (GUO) é uma molécula endógena da classe das purinas com efeitos neuroprotetores demonstrados em modelos de patologias in vivo e in vitro. Porém seu mecanismo de ação ainda não está completamente elucidado. Embora saiba-se do envolvimento dos receptores de adenosina, diversos efeitos neuroprotetores da GUO são revertidos ao bloquear o canal de potássio de alta condutância dependente de voltagem e cálcio (BK). Além disso, a adição de GUO no meio extracelular leva a abertura do canal. O BK é formado por um tetrâmero de subunidades-a podendo ou não possuir subunidades auxiliares ß ou ?. O canal é modulado por diversas moléculas que interagem no meio intracelular ou na parcela transmembrana; porém apenas os sítios de interação conhecidos para o ativador sintético 4-(4-(4-clorofenil)-3-(trifluorometil)isoxazol-5-il)benzeno-1,3-diol (CTIBD) são acessíveis pelo meio extracelular. Desta forma, este trabalho buscou analisar possíveis sítios de interação para GUO no BK por técnicas in silico. Para isso foram identificadas cavidades hidrofóbicas na parcela extracelular do canal BK, analisada a interação da GUO nestas cavidades por molecular docking e escolhida uma cavidade mais provável para ser o sítio de interação da GUO. Depois foi montado o complexo GUO-BK in silico inserido em uma membrana e solvatado em água e íons, com base em uma estrutura tridimensional do BK predita a partir da sequência aminoacídica. Como a cavidade escolhida coincidia com um dos sítios para o CTIBD, também foram feitas as mesmas análises com ele e ambas foram comparadas entre si. Foram encontradas 8 cavidades hidrofóbicas acessíveis pelo meio extracelular, e a mais provável foi escolhida com base na estrutura da cavidade, nos resultados do molecular docking, e na literatura. A GUO e o CTIBD foram posicionados na região desta cavidade e foram simulados os complexos BK-ligantes por 100 ns. Com base na trajetória resultante, foi identificado que ambos os ligantes permanecem dentro do sítio de interação ao longo dos 100 ns em todas as amostras. Também foram identificados os resíduos Gly18, Arg20, Trp22, Ser260, Gly261 e Phe267 como os mais importantes e mais prováveis de estarem envolvidos na interação do BK com a GUO ou com o CTIBD, através do cálculo do tempo de interação entre estes resíduos e os ligantes, chamada ocupância. Foi calculada a entalpia da interação do BK com os ligantes, com média de -13,9637 ± 4,2414 kcal/mol para o CTIBD e -14,6903 ± 3,2349 kcal/mol para a GUO, indicando afinidade semelhante do BK pelos ligantes. Os resíduos encontrados neste estudo já estão identificados na literatura como envolvidos na interação entre o BK e o CTIBD, assim, podem ser alvos de estudos futuros que busquem confirmar os resultados encontrados neste trabalho. Concluí-se, então, que a GUO possivelmente interage com o canal BK por meio do principal sítio de interação já conhecido como o sítio de interação para o CTIBD, envolvendo vários dos mesmos aminoácidos.

Abstract: Guanosine (GUO) is an endogenous molecule belonging to the purine class, with neuroprotective effects demonstrated in vivo and in vitro models of pathological conditions. However, its mechanism of action is not yet fully elucidated. Although the involvement of adenosine receptors is recognized, several neuroprotective effects of GUO are reversed when the large-conductance voltage- and calcium-activated potassium channel (BK) is blocked. Furthermore, the addition of GUO in the extracellular medium leads to channel opening. The BK channel is formed by a tetramer of a-subunits and may or may not include auxiliary ß or ? subunits; The channel is modulated by various molecules that interact within the intracellular environment or the transmembrane region; however only the interaction sites for 4-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol (CTIBD), a synthetic BK activator, are accessible from the extracellular medium. Thus, this study aimed to analyze potential GUO interaction sites on the BK channel using in silico approaches. Hydrophobic cavities in the extracellular medium portion of the BK channel were identified and GUO interaction within these cavities were evaluated through molecular docking. A cavity with the highest likelihood of being the GUO interaction site was then selected. Subsequently, the in silico GUO-BK complex was constructed, embedded in a membrane and solvated with water and ions, based on a three-dimensional BK structure predicted from its amino acid sequence. Since the selected cavity coincided with one of the known CTIBD binding sites, the same analyses were also performed for CTIBD and both ligands were compared. A total of eight hydrophobic cavities accessible from the extracellular environment were identified and the most plausible site was selected based on cavity structure, molecular docking results and literature evidence, GUO and CTIBD were positioned within this cavity region and the BK-ligand complexes were simulated for 100 ns in all samples. Residues Gly18, Arg20, Trp22, Ser260, Gly261 and Phe267 were identified as the most important and most likely to be involved in interactions with GUO or CTIBD, based on interaction time calculation (occupancy) between these residues and the ligands. The interaction enthalpy between BK and the ligands was also calculated, yielding average values of -13,9637 ± 4,2414 kcal/mol for CTIBD and -14,6903 ± 3,2349 kcal/mol for GUO, indicating similar affinity of BK for both ligands. The residues found in this study have already been reported in the literature as involved in BK-CTIBD interactions and may, therefore, serve as targets for future studies aimed at validating the findings of this work. In conclusion, GUO likely interact with the BK channel through the principal interaction site already described for CTIBD, involving several of the same amino acid residues.