Validação de um kit comercial de ELISA para determinação de cortisol plasmático em juvenis de miragaia (Pogonias courbina)

Abstract

O cortisol é o principal indicador fisiológico de estresse em peixes e é comumente quantificado por ELISA competitivo. Como os kits comerciais não são espécie-específicos, sua validação prévia é indispensável antes do uso em novas espécies. A miragaia (Pogonias courbina), peixe marinho nativo ameaçado de extinção e com potencial para aquicultura, carece de estudos sobre sua fisiologia do estresse. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio de diluições seriadas de plasma comparadas à curva-padrão de um kit comercial de ELISA (Cusabio), se amostras de miragaia apresentam paralelismo com o padrão do ensaio, etapa preliminar necessária à validação do método. Dezesseis juvenis foram anestesiados com eugenol e submetidos a coleta de sangue por punção caudal. O plasma foi separado por centrifugação, dividido em dois pools (oito peixes cada) e diluído seriadamente (1:1 a 1:16). A quantificação de cortisol seguiu o protocolo do kit Fish Cortisol ELISA (Cusabio), com leitura de absorbância a 450 nm em duplicata. As concentrações foram estimadas por interpolação em curva logística de quatro parâmetros (4PL) e corrigidas pelo fator de diluição. A curva-padrão apresentou ajuste de R² = 0,92, abaixo do valor mínimo recomendado (0,96). Os coeficientes de variação entre duplicatas foram elevados, atingindo 29,5% nos padrões e até 92,1% nas amostras, e não houve a monotonicidade decrescente esperada em ensaios competitivos. Também não houve paralelismo entre as diluições: a Amostra 1 variou cerca de sete vezes e a Amostra 2 cerca de cinco vezes entre os pontos interpoláveis, sem tendência de estabilização. Esses resultados indicam que o kit não pode ser considerado validado analiticamente para a miragaia nesta etapa. Eles não descartam, porém, a adequação biológica do kit à espécie, já que dificuldades semelhantes de paralelismo e precisão já foram relatadas na literatura para kits heterólogos em outras espécies de peixes. Recomenda-se repetir o ensaio, preferencialmente em triplicata, para padronizar a técnica e reavaliar o paralelismo como critério definitivo de validação do kit para uso em estudos futuros sobre a resposta da miragaia ao estresse.