O papel da membrana peritrófica na eficiência enzimática digestiva do Camarão-branco-do-Pacífico (Penaeus vannamei)

Abstract

O Penaeus vannamei foi o crustáceo mais cultivado no mundo em 2022 segundo à Fundação das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO). Todavia, a alimentação balanceada desses animais ainda é um entrave para a carcinicultura. Nesse sentido, esforços são direcionados para implementação de novos ingredientes na dieta desses camarões. Contudo, a fisiologia da digestão molecular em P. vannamei precisa ainda ser elucidada, pois há lacunas em estudos a respeito do intestino médio e o papel da membrana peritrófica (PM). Portanto, o objetivo é descrever o processo de digestão molecular em juvenis de P. vannamei com base na compartimentalização do intestino promovida pela PM. Portanto, os camarões foram submetidos a um tratamento com furosemida via gavagem para interromper a reciclagem de enzimas devido a interrupção de passagem de fluídos e água via NKCC e NKC. Com isso, atividade enzimática de enzimas de digestão inicial e final foram medidas tanto em mU/animal e mU/ µg de proteína nas porções: hepatopâncreas mais intestino anterior (HP), anterior do intestino médio (A), média do intestino médio (M), posterior do intestino médio (P) e intestino posterior (HD). Além disso, imagens de microscopia de luz (ML) foram preparadas com amostras de cortes longitudinais nas porções A, M e P de juvenis de P. vannamei para caracterização morfológica do intestino médio. Em adição, dados do transcriptoma de sequências de quitina sintase, quitinase, quitina deacetilase, mucina e peritrofina foram analisados nas porções HP, A, M, P e carcaça (C) para determinação da distribuição enzimática ao longo do intestino. As sequências de quitina, quitinase e quitina deacetilase, também foram usadas para montagem de árvores filogenéticas para determinação de suas funcionalidades através de homologia. Os resultados com furosemida não apontaram diferença significativa (a < 0,05) entre grupo tratamento e controle, apesar da obervação de tendências de deslocamento das enzimas para porções HP e A através de zimogramas, com exceção de a-galactosidase, que teve distribuição somente em HP. Os zimogramas de a-amilases e endopeptidases deram suporte a essa hipótese. Imagens de microscopia revelaram uma camada de células com grande vacúolo nas porções A, M e P, enquanto a camada de células com borda em escova (MGBC) somente foi vista em P. Além disso, a camada de MGBC se destaca em P para o lúmen intestinal através de secreção holócrina. Tratando-se da PM, imagens revelam que a PM forma uma camada fina em A, espessa em M e várias camadas em P. Os níveis de expressão das proteínas indicam que existe uma quitina sintase responsável pela ecdise e síntese da PM com maior nível em M. Para quitinase foram encontradas seis isoformas, com níveis mais altos no hepatopâncreas. Para quitinas deacetilases, três isoformas das cinco, foram encontradas mais expressas em P, o que pode indicar forte relação com a digestão. Resultados para as quatro isoformas encontradas de peritrofinas indicam que duas podem pertencer a família de peritrofinas ligadas à síntese de PM. Em relação às mucinas, são expressas em todo o intestino e das nove isoformas identificadas, cinco delas têm maior nível de expressão em P.

Abstract: The Penaeus vannamei was the most crustacean farmed over the world in 2022 according to the Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO). However, the balanced feeding of these animals is still an entry point for shrimp farming. In these sense, efforts are directed towards implemeting new ingredients in the diet of these shrimp. However, the mechanism of molecular digestion in P. vannamei still needs to be elucidated, as there are gaps in studies regarding the midgut and the role of the peritrophic membrane (PM). Thus the objective is to describe the molecular digestion process in juvenile P. vannamei based on the intestinal compartmentalization promoted by PM. Therefore, shrimp were subjected to furosemide treatment via gavage to interrupt enzyme recycling due to the interruption of fluid and water passage by NKCC e NKC. Thus, enzymatic activities of initial and final digestion enzymes were measured in both mU/animal and mU/µg of protein in the following portions: hepatopancreas plus foregut (HP), foregut (A), midgut (M), posterior midgut (P), and hindgut (HD). Furthermore, light microscopy (LM) images were prepared with longitudinal section samples from the A, M, and P portions of P. vannamei juveniles for morphological characterization of the midgut. Moreover, transcriptome data of chitin synthase, chitinase, chitin deacetylase, mucin, and peritrophin sequences were analyzed in the HP, A, M, P, and carcass (C) portions to determine enzyme distribution along the intestine. The chitin, chitinase, and chitin deacetylase sequences were also used to assemble phylogenetic trees to determine their functionalities through homology. The results with furosemide showed no significant difference (a < 0.05) between the treatment and control groups, despite the observation of trends of enzyme displacement to HP and A portions through zymograms, except for a-galactosidase, which was distributed only in HP. The zymograms of a-amylases and endopeptidases supported this hypothesis. Microscopy images revealed a layer of cells with a large vacuole in the A, M, and P portions, while the brush border cell (MGBC) layer was only seen in P. Furthermore, the layer detaches from P into the intestinal lumen through holocrine secretion. Regarding the PM, images reveal that the PM forms a thin layer in A, a thick layer in M, and several layers in P. Protein expression levels indicate a chitin synthase responsible for ecdysis and PM synthesis, with a higher level in M. Six isoforms of chitinase were found, with higher levels in the hepatopancreas. Five of the six isoforms of chitin deacetylases were found to be more highly expressed in P, which may indicate a strong link with digestion. Results for the four peritrophin isoforms found indicate that two may belong to the peritrophin family linked to PM synthesis. Regarding mucins, they are expressed throughout the intestine, and of the nine isoforms identified, five have a higher level of expression in P.