Complexos modificados de cobre/ triazaciclononano e novo modelo quimérico de nuclease artificial sítio-específico

Abstract

Os complexos metálicos geralmente são empregados na medicina com o papel de mimetizar a hidrólise natural da ligação fosfodiéster dos ácidos nucleicos e por isso também são conhecidos como metalonucleases artificiais. Para que estas moléculas sejam eficientes e seletivas em relação ao substrato que atuam, uma das estratégias utilizadas é incrementar a segunda esfera de coordenação. No primeiro capítulo, complexos de cobre (II) derivados de 1,4,7-triazaciclononano contendo grupos pendentes como: isopropoila (C1), pireno (C2), antraceno (C3), naftaleno (C4) e amino (C5), foram avaliados frente à capacidade de clivagem do DNA plasmidial, além de ser comparados ao modelo clássico da literatura (Cu[9]aneN3)Cl2. Todos os complexos testados apresentaram atividade catalítica em 4h (C2 e C5) e 8h (C1, C3 e C4). Em relação à temperatura, C5 foi ativo em 37 °C, diferentemente de C1-C4 (45 °C). C2 atuou como a melhor nuclease artificial,1000 vezes mais potente que o complexo clássico (Cu[9]aneN3)Cl2, seguindo a ordem C2 > C5 > C3 = C4 > C1 = (Cu[9]aneN3)Cl2. Em relação à especificidade, C1-C5 não são considerados seletivos ao DNA e atuam de forma inespecífica. Deste modo, para melhorar a especificidade das metalonucleases artificiais é comum ancorá-las peptídeos ou miniproteínas derivadas de fatores de transcrição, que se ligam especificamente ao ácido nucleico. Uma estratégia de ancoragem é a modificação quimio-seletiva de biomoléculas que envolve a conversão do aminoácido não abundante cisteína em dehidroalanina, seguida por adição de um ligante contendo grupo amino livre. Deste modo, a miniproteína recombinante 434wt, derivada do fator de transcrição cI do bacteriófago 434 que se liga à sequência 5´ACAA´3, e não contém resíduo de cisteína, foi escolhida, mutada (434cys; glicina25 → cisteína25) e empregada nos testes do capítulo 2. 434cys foi modificada quimicamente e ligada covalentemente ao grupo amino do ligante de C5. Finalmente, o bioconjugado obtido foi coordenado com cloreto de cobre (II), formando o novo híbrido 434_C5 . Em análises preliminares de redução da mobilidade eletroforética (EMSA) e clivagem direta, 434_C5 interagiu e clivou o DNA de forma sítio-específica. Como conclusão, todas as hipóteses propostas de melhorar a atividade catalítica e a especificidade dos complexos metálicos foram atingidas. Palavras-chave: cobre, triazaciclononano, repressor cI.

Abstract: Metal complexes are generally employed in medicine with the role of mimicking the natural hydrolysis of nucleic acid phosphodiester acids and are therefore also known as artificial metallonucleases. For these molecules being efficient and selective in relation to the substrate they act on, one of the strategies used is to increase the second coordination sphere. In the first chapter, copper (II) complexes derived from 1,4,7-triazacyclononane containing pending groups such as: isopropoyl (C1), pyrene (C2), anthracene (C3), naphthalene (C5) and amino (C5), were evaluated ahead of cleavage capacity of plasmid DNA, in addition to being compared to the literature classical model (Cu[9]aneN3)Cl2. All complexes tested showed catalytic activity during 4h (C2 and C5) and 8h (C1, C3 and C4). Respect to temperature, C5 was active at 37°C, unlike C1-C4 (45°C). C2 acted as the best artificial nuclease, 1000 times more potent than the classical complex (Cu[9]aneN3)Cl2, following the order C2 > C5 > C3 = C4 > C1 = (Cu[9]aneN3)Cl2. Regarding specificity, C1-C5 are not considered selective to DNA and act in a non-specific way. Thus, to improve the specificity of artificial metallonucleases, it is common to anchor them peptides or miniproteins derived from transcription factors, which bind specifically to nucleic acid. One anchoring strategy is chemo-selective modification of biomolecules, that involves the conversion of the non-abundant amino acid cysteine into dehydroalanine, followed by the addition of a ligand containing free amine group. Thus, the recombinant miniprotein 434wt, derived from the transcription factor cI of bacteriophage 434 that binds to the sequence 5 ´ ´ACAA ´ ´3, and does not contain cysteine residue was chosen, mutated (434cys; glycine25 → cysteine25) and employed in tests of chapter 2. 434cys was chemically modified and covalently bonded to the amine group of C5 ligand. Finally, the bioconjugate obtained was coordinated with copper (II) chloride, forming the new hybrid 434_C5. In preliminary analysis of electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and direct cleavage, 434_C5 interacted with and cleaved DNA in a site-specific manner. As a conclusion, all hypotheses proposed about improving the catalytic activity and specificity of metallic complexes were achieved.