Sinalização de p53 mutante e interleucina-8: caracterização funcional e influência na patogênese do câncer de mama triplo-negativo

Abstract

Os tumores mamários do subtipo triplo-negativo (TNBC) possuem alta frequência de mutações no gene do supressor tumoral p53 (TP53) e elevada expressão de interleucina-8 (IL-8), sendo considerados os mais agressivos e desafiadores, do ponto de vista terapêutico. Esta tese teve como objetivo estudar a relação entre as mutações do tipo ganho-de-função (GOF) em TP53 no câncer de mama e a IL-8 expressa por tumores mamários. Para isso, utilizou-se modelos celulares, ferramentas de silenciamento gênico e análises histológicas e de bioinformática. Inicialmente, o estudo revelou que a depleção da p53 mutante tornou as linhagens celulares TNBC suscetíveis ao tratamento com Metanossulfonato de metila (MMS) e cisplatina, reduziu o potencial de invasão, migração e a expressão de citocinas próinflamatórias, incluindo CXCL2, IL-8 e IL-6 em linhagens celulares TNBC. No entanto, moléculas associadas à malignidade do câncer de mama, como PGE2 e MMP1, reguladas pela via de sinalização ERK1/2 MAPK, não foram afetadas pela depleção de p53 mutante. O tratamento com inibidores de MEK1/2 demonstrou uma diminuição na produção de citocinas, e a combinação da inibição destas duas vias de sinalização resultou em uma redução aprimorada de IL-8 e IL-6, além de redução na invasão e migração celular, em comparação com cada tratamento isolado. A inibição da sinalização do NF?B também contribuiu para diminuição da viabilidade celular e da produção de citocinas. Embora a depleção de p53 mutante não tenha afetado o status de fosforilação do MEK/ERK1/2 ou dos complexos NF?B, foi observada uma diminuição da atividade do NF?B no núcleo, indicando seu papel na regulação da atividade do NF?B em linhagens celulares TNBC. Esses achados indicam que mutações GOF do TP53 contribuem com ERK1/2 MAPK e NF?B para a produção do secretoma inflamatório em linhagens celulares TBNC. Sabendo que a IL-8 é produzida por subtipos específicos de câncer de mama e contribui para fenótipos malignos, especialmente no câncer de mama TBNC, nós revisitamos o perfil de expressão e a importância funcional da IL-8. O estudo revelou que há uma ampla faixa de expressão de CXCL8 (mRNA de IL-8) em tumores mamários e linhagens de câncer de mama. Análises de enriquecimento funcional de genes e mutações indicaram uma sinalização inflamatória aumentada e uma resposta ao estrogênio diminuída associada a níveis mais elevados de CXCL8 em tumores de mama. A expressão de CXCL8 se mostrou aumentada em tumores do subtipo molecular tipo-basal e claudin-low. Notavelmente, mutações no gene TP53 foram associadas a altos níveis de expressão de CXCL8. Além disso, foram observados níveis elevados de CXCL8 e secreção de IL-8 em um painel de linhagens celulares do tipo-basal e claudin-low, as quais apresentaram maior invasividade, quando comparado a linhagens de fenótipo RE+ (ou luminais). A redução da expressão de CXCL8 por siRNA ou antagonista de receptor CXCR1/2 demonstrou uma diminuição significativa na viabilidade, invasão e potencial de migração de linhagens celulares triplo-negativas/claudin-low de câncer de mama, indicando um papel importante da via IL-8/CXCR1/2 na malignidade tumoral. Esses achados fornecem insights importantes sobre a interação entre IL-8, mutações GOF em TP53 e resposta inflamatória no câncer de mama, destacando alvos terapêuticos e estratégias potenciais para melhorar a eficácia do tratamento do câncer de mama.

Abstract: Triple-negative breast cancer (TNBC) have high frequency of mutations in the tumor suppressor gene p53 (TP53) and elevated expression of interleukin-8 (IL-8), making them the most aggressive and challenging subtype from a therapeutic standpoint. This thesis aimed to study the relationship between gain-of-function (GOF) mutations in TP53 in breast cancer and the IL-8 expressed by mammary tumors. To do this, cellular models, gene silencing tools, and histological and bioinformatic analyses were employed. Initially, the study revealed that depletion of mutant p53 rendered TNBC cell lines susceptible to treatment with Methyl methanesulfonate (MMS) and cisplatin, reduced invasion and migration potential, and decreased the expression of pro-inflammatory cytokines, including CXCL2, IL-8, and IL-6 in TNBC cell lines. However, molecules associated with breast cancer malignancy, such as PGE2 and MMP1, regulated by the ERK1/2 MAPK signaling pathway, were not affected by mutant p53 depletion. Treatment with MEK1/2 inhibitors showed a decrease in cytokine production, and the combination of inhibiting these two signaling pathways resulted in enhanced reduction of IL-8 and IL-6, as well as decreased cell invasion and migration compared to each treatment alone. Inhibition of NF?B signaling also contributed to decreased cell viability and cytokine production. While mutant p53 depletion did not affect the phosphorylation status of MEK/ERK1/2 or NF?B complexes, decreased NF?B activity in the nucleus was observed, indicating its role in NF?B activity regulation in TNBC cell lines. These findings indicate that GOF mutations in TP53 contribute to ERK1/2 MAPK and NF?B signaling for the production of the inflammatory secretome in TNBC cell lines. Knowing that IL-8 is produced by specific subtypes of breast cancer and contributes to malignant phenotypes, especially in TNBC, we revisited the expression profile and functional importance of IL-8. The study revealed a wide range of CXCL8 (IL-8 mRNA) expression in mammary tumors and breast cancer cell lines. Functional enrichment analyses of genes and mutations indicated increased inflammatory signaling and decreased estrogen response associated with higher levels of CXCL8 in breast tumors. CXCL8 expression was elevated in basal-like and claudin-low molecular subtype tumors. Notably, TP53 gene mutations were associated with high levels of CXCL8 expression. Furthermore, elevated levels of CXCL8 and IL-8 secretion were observed in a panel of basal-like and claudin-low cell lines, which exhibited higher invasiveness compared to RE+ (luminal) phenotype lines. Reducing CXCL8 expression using siRNA or CXCR1/2 receptor antagonists demonstrated a significant decrease in viability, invasion, and migration potential of triple-negative/claudin-low breast cancer cells, indicating an important role of the IL-8/CXCR1/2 pathway in tumor malignancy. These findings provide important insights into the interaction between IL-8, GOF mutations in TP53, and inflammatory response in breast cancer, highlighting therapeutic targets and potential strategies to enhance the effectiveness of breast cancer treatment.