Avaliação do possível efeito protetor da metformina via gene SKN-1 em Caenorhabditis elegans submetidos à ferroptose

Abstract

O ferro é um metal essencial à manutenção da vida de inúmeras espécies animais, incluindo a humana. Apesar da essencialidade deste elemento químico, seu excesso pode levar a uma condição denominada ?sobrecarga de ferro? (do inglês, iron-overload). Neste contexto, o excesso de ferro pode contribuir para a formação de radicais livres e oxidação de fosfolipídios de membrana, o que atualmente tem sido relacionado à morte celular ferroptótica. Esse tipo de morte celular regulada e não-apoptótica caracteriza-se principalmente pela oxidação de ácidos graxos poli-insaturados, níveis elevados de espécies reativas de oxigênio (EROs) e diminuição dos níveis do antioxidante glutationa (GSH). Dentre as moléculas endógenas que podem inibir o desenvolvimento da ferroptose, tem-se a glutationa peroxidase 4 (GPx4), o sistema xCT e o fator de transcrição Nrf-2 (codificado pelo gene NRF-2 em mamíferos), fator ortólogo ao gene SKN-1 no nematoide Caenorhabditis elegans. Este fator de transcrição desempenha um papel chave na expressão de diversas proteínas antioxidantes, incluindo o próprio sistema xCT. A metformina, um fármaco extensivamente prescrito para o tratamento do diabetes, pode modular positivamente a via do Nrf-2 em mamíferos, através de um leve aumento da produção mitocondrial de EROs, ativando defesas antioxidantes endógenas. Entretanto, o papel da metformina na regulação da ferroptose ainda é pouco conhecido. Desta forma, a presente dissertação teve como objetivo a realização de um estudo para investigar se a metformina pode prevenir a morte celular ferroptótica, através do fator SKN-1, induzida por uma sobrecarga de ferro com citrato férrico amoniacal (FAC) em C. elegans. De forma a alcançar o objetivo geral, a metodologia foi dividida em quatro fases principais: (I) análise da toxicidade (letalidade) induzida por FAC e metformina; (II) análise do possível efeito protetor da metformina contra a toxicidade induzida por FAC; (III) avaliação de um marcador de ferroptose (peroxidação lipídica) nos animais expostos ao FAC e/ou metformina; e (IV) avaliação do efeito da metformina na expressão da proteína glutathiona-S-transferase (GST-4), a qual representa um alvo downstream do fator SKN-1. Nossos resultados demonstraram que a metformina, quando em contato prévio com bactérias Escherichia coli OP50, protege conta a mortalidade e a peroxidação lipídica induzida pelo modelo de iron-overload em nematoides selvagens (cepa N2), porém, não em nematoides nocautes para o gene SKN-1 (cepa QV225). Além disso, o tratamento com 50 mM de metformina (após metabolizada pela bactéria E. coli - OP50), durante 44 horas e iniciado em estágio L1, aumentou a expressão da proteína GST-4 marcada com GFP em animais tipo selvagens N2 (59%); porém, na cepa nocaute para SKN-1, o aumento da expressão foi pouco expressivo (17%). Em conjunto, nossos dados demonstram que a proteção induzida pelo tratamento com metformina contra a mortalidade e a peroxidação lipídica induzidos pelo modelo de iron-overload (exposição ao FAC) depende da metabolização da metformina pela bactéria E. coli e do gene SKN-1 em C. elegans.

Abstract: Iron is an essential metal for the maintenance of life in several animal species, including humans. Despite the essentiality of this element, its excess can lead to a condition called \"iron-overload\". In this context, excess iron can contribute to the generation of free radicals and oxidation of membrane phospholipids, which have now been linked to ferroptotic cell death. This type of regulated and non-apoptotic cell death is mainly characterized by the oxidation of polyunsaturated fatty acids, increased levels of reactive oxygen species (ROS), and decreased levels of the antioxidant glutathione (GSH). Among the endogenous molecules that can inhibit ferroptosis, there are glutathione peroxidase 4 (GPx4), xCT system, and transcription factor Nrf-2 (encoded by the NRF-2 gene in mammals), an orthologous factor to SKN-1 gene present in the nematode Caenorhabditis elegans. This transcription factor plays a key role in the expression of several antioxidant proteins, including the xCT system itself. Metformin, a drug extensively prescribed for the treatment of diabetes, can positively modulate the Nrf-2 pathway in mammals through a slight increase in mitochondrial production of ROS, activating endogenous antioxidant defenses. However, the role of metformin in the regulation of ferroptosis is still poorly understood. Thus, the present dissertation aimed to conduct a study to investigate whether metformin can prevent ferroptotic cell death, through SKN-1 factor, induced by iron overload - ammoniacal ferric citrate (FAC) treatment - in C. elegans. In order to achieve the overall objective, the methodology was divided into four main phases: (I) analysis of the toxicity (lethality) induced by FAC and metformin; (II) analysis of the possible protective effect of metformin against FAC-induced toxicity; (III) evaluation of a marker of ferroptosis (lipid peroxidation) in animals exposed to FAC and/or metformin; and (IV) evaluation of the effect of metformin on the expression of glutathione-S-transferase (GST-4) protein, which represents a downstream target of SKN-1. Our results demonstrated that metformin, when pre-incubated with Escherichia coli OP50 bacteria, protects against mortality and lipid peroxidation induced by the iron-overload model in wild type nematodes (N2 strain), but not in SKN-1 knockout nematodes (strain QV225). Furthermore, a 44 hours (initiated at L1 stage) treatment with 50 mM metformin, after OP50 bacteria metabolism, increased GFP-tagged GST-4 protein expression in N2 wild-type animals (59%); however, in the SKN-1 knockout strain, the increase in expression was negligible (17%). Taken together, our data demonstrate that the protection of metformin against mortality and lipid peroxidation induced by the iron-overload model in C. elegans is dependent on metformin metabolism by E. coli bacteria and on the SKN-1 gene.