Estratégias experimentais para a modulação da ferroptose visando à proteção em modelos de dano oxidativo neuronal in vitro e in vivo

Abstract

A homeostase do cérebro de mamíferos é mantida por um arranjo complexo de tipos celulares heterogêneos que orquestram o metabolismo e a neurotransmissão. Tal equilíbrio é comumente perturbado em condições neuropatológicas crônicas, tais como doenças de Parkinson e Alzheimer, e condições agudas, como o acidente vascular cerebral isquêmico. Estas condições têm a neuroinflamação e o estresse oxidativo como mecanismos centrais, sendo o último recentemente ligado a uma nova forma oxidativa de morte celular chamada ferroptose. Neste trabalho, propusemos duas estratégias experimentais em modelos distintos, que objetivaram reduzir a morte neuronal causada pela ferroptose. A primeira investigou se um análogo inédito do probucol, 4,4'-Diselanediilbis (2,6-di-tert-butilfenol) ou C2, o qual demonstrou propriedades anti-ferroptóticas in vitro, seria capaz de induzir efeitos protetores em um cenário fisiopatológico in vivo de dano oxidativo e ferroptótico. Para isto, ratos Wistar adultos foram submetidos a um acidente vascular cerebral (AVC) isquêmico focal experimental por meio de injeções centrais do vasoconstritor endotelina-1 (ET-1; 800 pmol/sítio). O composto C2 foi selecionado com base em sua baixa toxicidade in vivo, sendo administrado (20 e 50 mg/kg, i.p.) em 1, 24, 48 e 72 h após a administração de ET-1. Realizaram-se testes comportamentais relacionados ao desempenho motor (teste de remoção do adesivo, teste de equilíbrio em feixe e teste do cilindro) no dia 5 após a indução da isquemia. Após os testes comportamentais, todos os animais foram perfundidos e os cérebros coletados para análises imunohistoquímicas da proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Os animais que receberam apenas ET-1 tiveram significativo comprometimento motor e sensorial, e gliose reativa. Em contraste, animais tratados com ET-1 + C2 mostraram recuperação significativa dos prejuízos motores e sensoriais induzidos por ET-1, além de redução da gliose reativa. Em um modelo in vitro utilizando cultivos celulares, investigamos o potencial protetor inexplorado dos produtos da ativação microglial contra um dano ferroptótico induzido por glutamato em células neuronais HT22. Cultivos de células microgliais (BV-2) foram estimulados com 5-100 ng/mL lipopolissacarídeo (LPS) por 24 h e, após confirmação da ativação microglial, seu meio de cultura (meio condicionado; MC) foi transferido para células neuronais HT22, as quais foram posteriormente (6 h depois) expostas a altas concentrações de glutamato (modelo clássico de ferroptose) ou terc-butil hidroperóxido (t-BuOOH). Como achado principal, as células HT22 pré-tratadas por 6 h com MC derivado de células BV-2 estimuladas com LPS exibiram significativa resistência à ferroptose, caracterizada pela diminuição da sensibilidade à citotoxicidade induzida por glutamato (15 mM). No entanto, não foram observados efeitos protetores significativos do MC em células desafiadas com t-BuOOH (30 µM). Esses resultados indicam que moléculas derivadas de micróglias ativadas podem proteger as células neuronais contra a ferroptose induzida pelo glutamato, mas não contra outros danos de natureza oxidativa, como os induzidos pelo t-BuOOH. Nosso trabalho destacou os produtos da ativação microglial e o promissor análogo C2 como inibidores da morte celular ferroptótica, trazendo novas possibilidades para o tratamento ou melhora da qualidade de vida de pacientes que sofreram AVC isquêmico.

Abstract: Mammalian brain homeostasis is maintained by a complex array of heterogeneous cell types that orchestrate metabolism and neurotransmission. Such balance is commonly disturbed in chronic neuropathological conditions, such as Parkinson's and Alzheimer's diseases, and acute conditions, such as ischemic stroke. These conditions have neuroinflammation and oxidative stress as central mechanisms, the latter being recently linked to a new oxidative form of cell death called ferroptosis. In this work, we proposed two experimental strategies in different models, which aimed to reduce neuronal death caused by ferroptosis. The first investigated whether a novel probucol analogue, 4,4'-Diselanediylbis (2,6-di-tert-butylphenol) or C2, which demonstrated anti-ferroptotic properties in vitro, would be able to induce protective effects in a pathophysiological scenario of oxidative and ferroptotic damage in vivo. For this, adult Wistar rats were submitted to an experimental focal ischemic stroke via central injections of the vasoconstrictor endothelin-1 (ET-1; 800 pmol/site). Compound C2 was selected on the basis of its low toxicity in vivo, being administered (20 and 50 mg/kg, i.p.) at 1, 24, 48 and 72 h after ET-1 administration. Behavioral tests related to motor performance (adhesive removal test, beam balance test and cylinder test) were performed on day 5 after induction of ischemia. After behavioral tests, all animals were perfused and brains collected for immunohistochemical analysis of glial fibrillary acidic protein (GFAP). Animals that received only ET-1 had significant motor and sensory impairment, and reactive gliosis. In contrast, animals treated with ET-1 + C2 showed significant recovery from ET-1-induced motor and sensory impairments, in addition to a reduction in reactive gliosis. In an in vitro model using cell cultures, we investigated the unexplored protective potential of microglial activation products against glutamate-induced ferroptotic damage in HT22 neuronal cells. Microglial cell cultures (BV-2) were stimulated with 5-100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) for 24 h and, after confirmation of microglial activation, their culture medium (conditioned medium; CM) was transferred to HT22 neuronal cells, which were later (6 h later) exposed to high concentrations of glutamate (classical model of ferroptosis) or tert-butyl hydroperoxide (t-BuOOH). As a main finding, HT22 cells pretreated for 6 h with CM derived from LPS-stimulated BV-2 cells exhibited significant resistance to ferroptosis, characterized by decreased sensitivity to glutamate-induced cytotoxicity (15 mM). However, no significant protective effects of CM were observed in cells challenged with t-BuOOH (30 µM). These results indicate that molecules derived from activated microglia can protect neuronal cells against glutamate-induced ferroptosis, but not against other oxidative damage, such as those induced by t-BuOOH. Our work highlighted the products of microglial activation and the promising C2 analogue as inhibitors of ferroptotic cell death, bringing new possibilities for the treatment or improvement of the quality of life of patients who have suffered ischemic stroke.