Potencial citotóxico e antiproliferativo de novos selenoésteres derivados de diidropirimidinonas: estudo in vitro e in silico

Abstract

O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento celular desordenado e por alterações na fisiologia das células. Estima-se um aumento mundial de 45% no número de mortes por câncer entre 2007 e 2030. Este cenário tem incentivado vários pesquisadores a realizar grande esforço no isolamento e síntese de novas moléculas com potencial antitumoral. Os estudos com derivados de dihidropirimidinona (DHPM) e os compostos de organoselênio têm demonstrado resultados muito promissores com relação às suas atividades biológicas, incluindo ao seu potencial antitumoral. Assim, o objetivo dessa pesquisa foi avaliar o potencial antitumoral in vitro e predizer in silico algumas das possíveis interações de compostos híbridos formados por selonoéster e dihidropirimidinonas (DHPM-Se) com o DNA. A citotoxicidade dos compostos foi avaliada utilizando o ensaio MTT para linhagens celulares tumorais (HeLa, HepG-2 e MCF-7) e não tumoral (McCoy). Após 72 horas, a maioria dos compostos apresentou maior toxicidade do que o monastrol. Esta dihidropirimidinona foi empregada como um controle positivo neste ensaio. Os compostos 49A, 49E e 49H foram os que apresentaram maior citotoxicidade (CI50= 7,42; 8,32 e 7,78 µM; respectivamente) para HepG2 e com os melhores índices de seletividade (IS = 4,24; 3,66 e 4,38 µM; respectivamente). O tratamento com composto 49H (CI30= 4,7 µM; 72 h) apresentou efeito antiproliferativo, reduzindo a formação de colônias. Enquanto os compostos 49A e 49E não diferiram do grupo controle. O composto 49H (CI30= 4,7 µM; 72 h) causou uma redução de 42% no número de células viáveis e aumentou em seis vezes a frequência da morte celular por apoptose. Adicionalmente, este composto aumentou a expressão das proteínas p53 (60%) e BAX (80%), e causou uma redução na expressão do HIF-1a (16%). Os ensaios moleculares mostraram que o 49H causou perturbação estrutural no CT-DNA indicado pelo efeito hipocrômico e pelo deslocamento do intercalante iodeto de propídeo (IP). Os estudos in silico de docking e de dinâmica molecular predisseram o composto 49H como um ligante de fenda menor no DNA e não um agente intercalador. O resultado do ensaio cometa revelou que o índice de dano ao DNA nas células HepG2 tratadas com o 49H (CI30= 4,7 µM; 72 h) foi 1,5 vezes maior que no controle negativo. Corroborando estes dados, a expressão de ?H2AX foi 2,3 vezes maior para células HepG2 tratadas em comparação com o controle. Porém, o tratamento com 49H não causou a clivagem da PARP. No entanto, a expressão desta proteína foi fortemente reduzida (60%) na presença do composto em comparação com o controle. A análise do ciclo celular revelou que o tratamento com 49H (4,7 µM; 72 h) aumentou o número de células HepG2 na fase G1 em mais de 20% e reduziu em cerca de 40% a frequência de células na fase S, quando comparado ao controle. Com relação ao controle do ciclo celular, os resultados de imunodetecção revelaram uma redução nos níveis de RB fosforilada e de ciclina A em 21% e 43%, respectivamente comparado ao controle. Os conjuntos de resultados obtidos demostraram que o composto 49H tem um potencial promissor como composto líder para o desenvolvimento de fármaco antitumoral para o tratamento de hepatocarcinoma. Além disso, foi investigado o potencial das DHPM-Se frente a linhagem tumoral de adenocarcinoma mamário humano (MCF-7). Entre os oito compostos DHPM-Se testados, apenas 49A e 49F foram os mais citotóxicos para MCF-7 (CI50= 11,3 e 5,46 µM; respectivamente) e os mais seletivos para a linhagem não tumoral (IS = 2,8 e 3,3 µM; respectivamente) e reduziram a viabilidade celular de uma maneira dependente do tempo e da concentração. Usando a concentração de IC30 somente o composto 49F (3,5 µM) mostrou capacidade antiproliferativa reduzindo em mais de 60% a formação de colônias. Ambos compostos reduziram em mais de 30% a viabilidade das células MCF-7. O composto 49A aumentou em 3,5 vezes a frequência de apoptose e em 2,0 vezes a frequência de necrose. Enquanto que o composto 49F elevou em 2,5 vezes a frequência desses dois tipos de morte. No ensaio molecular, o 49A interagiu com o CT-DNA e causou hipercromismo, enquanto o 49F causou um efeito hipocrômico. O ensaio de intercalação revelou que os dois compostos causaram desestabilização na molécula de CT-DNA. Esse efeito foi evidenciado pela perda de fluorescência quando os compostos competiram e causaram o deslocamento do iodeto de propídeo. Simulações (docking e dinâmica molecular) usando B-DNA trouxeram um maior entendimento das interações do complexo ligante-B-DNA. Além disso, estes ensaios previram que os compostos atuaram como ligantes de sulco menor com estabilização do complexo devida às ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas. No entanto, a forma de interação prevista para 49F foi mais favorável energeticamente e teve ligações de hidrogênio mais estáveis durante o tempo de simulação. Apesar de algumas violações previstas no ADMET para 49F, o conjunto de outros resultados apontam para 49F como um composto líder promissor com potencial antitumoral para câncer de mama especialmente depois de submetido a otimizações adicionais.

Abstract: Cancer is a disease characterized by disordered cell growth and changes in cell physiology. Estimates showed a worldwide increase of 45% in cancer deaths between 2007 and 2030. This scenario has encouraged several researchers to make a major effort to isolate and synthesize new molecules with antitumor potential. Studies with dihydropyrimidinone derivatives (DHPMs) and organoselenium compounds have shown very promising results regarding their biological activities, including their antitumor potential. Thus, the objective of this research was to evaluate the in vitro antitumor potential and in silico molecular interactions of hybrid compounds formed by selonoester and dihydropyrimidinone (DHPM-Se) with DNA. Cytotoxicity of the compounds was evaluated using the MTT assay for tumor (HeLa, HepG-2, HRT-18 and MCF-7) and non-tumor (McCoy) cell lines. After 72 hours, most compounds showed higher toxicity than monastrol. This dihydropyrimidinone was used as positive control to tumor cells. Compounds 49A, 49E and 49H were the most cytotoxic for HepG2 (IC50 = 7.42; 8.32 and 7.78 µM; respectively) and with the best selectivity indices (IC50 = 4.24, 3.66 and 4.38 µM; respectively). Compound 49H (IC30 = 4.7 µM; 72 h) showed antiproliferative effect, reducing colony formation. While compounds 49A and 49E did not differ from the control group. Compound 49H (IC30 = 4.7 µM; 72 h) reduced the number of viable cell (42%) and increased the frequency of apoptotic cell death by six-fold. Additionally, this compound increased the expression of p53 (60%) and BAX (80%) proteins, and caused a reduction in HIF-1a expression (16%). Molecular assays showed that 49H caused structural disturbance in the CT-DNA indicated by the hypochromic effect and by the displacement of the propidium iodide (PI) intercalant. In silico docking and molecular dynamics studies suggest that 49H is a DNA minor groove-binding ligand in DNA and not an intercalating agent. The result of the comet assay revealed that the DNA damage index in 49H-treated HepG2 cells (IC30 = 4.7 µM; 72 h) was 1.5 times higher than in the negative control. Corroborating these data, ?H2AX expression was 2.3 times higher for treated HepG2 cells comparatively to the control. Although, the treatment with 49H did not cause PARP cleavage, the expression of this protein was strongly reduced (60%) in the presence of the compound when compared to control. Cell cycle analysis revealed that 49H (IC30 = 4.7 µM; 72 h) caused cell arrest in more than 20% of cells in the G1 phase and reduced the frequency of S phase cells by about 40% comparatively to control. Regarding cell cycle control, western blot results revealed a reduction in phosphorylated RB and cyclin A levels by 21% and 43% respectively when compared to control. The results show that 49H has promising potential as a leading compound for the development of antitumor drug for the treatment of hepatocarcinoma. In addition, we investigated the potential of DHPM-Se against the tumoral line of human mammary adenocarcinoma (MCF-7). Among the eight DHPM-Se compounds tested, only 49A and 49F were the most cytotoxic for MCF-7 (IC50 = 11.3 and 5.46 µM; respectively) and the most selective for the non-tumor cells (IS = 2.8 and 3.3 µM, respectively) and reduced cell viability in a time and concentration dependent manner. Using the IC30 concentration, only the 49F compound (3.5 µM) showed antiproliferative capacity, reducing colony formation by more than 60%. Both compounds reduced the viability of MCF-7 cells by more than 30%. Compound 49A increased the frequency of apoptosis by 3.5 times and by 2.0 times the frequency of necrosis. While the 49F compound increased the frequency of these two types of death by 2.5 times. In the molecular assay 49A interact with CT-DNA and caused hyperchromism while 49F caused a hypochromic effect. The intercalation test revealed that the two compounds caused destabilization in the CT-DNA molecule. This effect was evidenced by the loss of fluorescence when the compounds competed and caused the displacement of propidium iodide. Simulations (docking and molecular dynamics) using B-DNA brought a greater understanding of ligand-B-DNA interactions. Furthermore, they predicted that the compounds act as minor groove ligands and the complex are stabilized through hydrogen bonds and hydrophobic interactions. However, the form of interaction foreseen for 49F was more energetically favorable and had more stable hydrogen bonds during the simulation time. Despite some violations foreseen in the ADMET for 49F, the set of other results point to DHPM-Se as a promising leader compound, with anti-tumor potential for breast cancer, especially after submitted to further optimizations.