Indução de formação de neuroesferas enriquecidas em células-tronco tumorais

Abstract

Os glioblastomas (GBMs) são tumores caracterizados por possuírem altas taxas proliferativas e alto poder invasivo, resultando em maior malignidade e resistência a tratamentos farmacológicos padrão. Um dos principais responsáveis por estas características em vários tipos de câncer, as células-tronco tumorais (CTTs), são também responsáveis pela origem e manutenção tumoral. Células de GBM quando cultivadas em neuroesferas, modelo tridimensional (3D), compartilham características de CTTs, o que representa uma estratégia metodológica para o estudo de novos fármacos antitumorais. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para formação de neuroesferas a partir de células de GBM humano da linhagem SF-295, e em sequência testar o potencial farmacológico do mesilato de doxazosina, um fármaco que tem demonstrado um promissor potencial antineoplásico. O protocolo de formação de neuroesferas foi realizado a partir de experimentos para a definição de densidade celular, condições de meio de cultivo e concentração do gel de agarose, o suporte a ser utilizado. Em sequência, foram avaliados o volume e a quantidade de células nas culturas 3D, seguido da análise comparativa da presença de marcadores de CTTs (CD44, CD133 e OLIG2) em culturas de monocamada (2D) e 3D. A ação antineoplásica do mesilato de doxazosina foi testada no modelo 2D através de análises quantitativas de morte e quantidades de DNA em cada fase do ciclo celular. Por fim, as células das culturas de ambas as condições, 2D e 3D foram expostas ao fármaco, com o objetivo de analisar seu efeito nas células marcadas para o fenótipo de CTTs. Nossos resultados mostraram que apenas o fato de as células serem cultivadas pelo modelo 3D, sem acréscimo de fatores de crescimento ao meio, foi suficiente para induzir aumento do marcador CD44, quando comparado às células do modelo 2D. O mesilato de doxazosina apresentou efeito antineoplásico sobre células em ambos os modelos (2D e 3D), induzindo morte celular por apoptose no modelo 2D, apesar de sua ação não ser significativa sobre CTTs (modelo 2D e 3D), nas concentrações utilizadas. O uso de neuroesferas, com a finalidade de avaliar ensaios de toxicidade e resistência celular, representa um método apropriado para testes farmacológicos de antitumorais, direcionados especificamente para CTTs.

Abstract: Glioblastomas (GBMs) are tumors characterized by having high rates of proliferation and high invasive power, resulting in greater malignancy and resistance to standard pharmacological treatments. One of the main responsible for these characteristics in several types of cancers is cancer stem cells (CSCs). These cells are responsible for the origin and maintenance of the tumor. GBM cells when cultured in neurospheres, a three dimensional model (3D), share many characteristics of CSCs, which represents a methodological strategy for the study of new antitumor agents. The objective of this work was to develop a protocol for the formation of neurospheres from human GBM cells (SF-295 lineage), and in sequence to test the pharmacological potential of doxazosin mesylate, a drug seen as a promising antineoplastic potential. The neurosphere formation protocol was carried out based on experiments for the definition of cell density, conditions of culture medium and concentration of the agarose gel to be used. In sequence, cell volume and quantification were evaluated in 3D cultures, followed by a comparative analysis of the presence of CSCs markers (CD44, CD133 and OLIG 2) in monolayer (2D) and 3D cultures. The antineoplastic action of doxazosin mesylate was tested in the 2D model by means of quantitative analyzes of cell death and cell cycle. Finally, cells from both cultures, 2D and 3D, were exposed to the drug, in order to analyse the response of the cells labelled for the CTT phenotype. Our results showed that just the fact that the cells were cultured by the 3D model, without adding growth factors to the medium, was sufficient to induce an increase in the CD44 marker, when compared to the cells of the 2D model. Doxazosin mesylate showed an antineoplastic effect on cells in both models (2D and 3D), inducing cell death in the 2D model, although its action is not significant on CSCs (2D and 3D model), at the concentrations used. The use of neurospheres, for the purpose of assessing toxicity and testing cell resistance, represents an appropriate method for pharmacological testing of antitumor drugs, specifically directed at CSCs.