Mecanismos de ação associados ao efeito tipo-antidepressivo da guanosina

Abstract

A depressão é um transtorno de humor prevalente e cujo tratamento apresenta limitada eficácia, efeitos adversos e resposta terapêutica tardia. Desse modo, se faz necessária a busca por novos alvos terapêuticos com melhor perfil farmacológico. Nesse contexto, a guanosina, um nucleosídeo endógeno, que apresenta efeito tipo-antidepressivo e neuroprotetor em estudos pré-clínicos foi investigada no presente estudo. Avaliamos os mecanismos de ação relacionados ao efeito tipo-antidepressivo da guanosina bem como alterações morfológicas associadas a este efeito. Em um primeiro conjunto de experimentos buscamos investigar o papel das vias de sinalização GSK-3ß, MAPK/ERK e Nrf2/HO-1 no efeito tipo-antidepressivo da guanosina no teste de suspensão pela cauda (TSC) em camundongos. Para isso, os animais foram tratados com guanosina em combinação com cloreto de lítio (inibidor não-seletivo da GSK-3ß, 10 mg/kg, p.o.), AR-A014418 (inibidor seletivo da GSK-3ß, 0,01 µg/sítio, i.c.v.), U0126 (5 µg/sítio, i.c.v., inibidor da MEK1/2), PD98059 (5 µg/sítio, i.c.v., inibidor da MEK1/2) ou protoporfirina de zinco (ZnPP) (inibidor da HO-1, 10 µg/sitío, i.c.v.) e foram submetidos ao TSC e teste do campo aberto (TCA). Foi realizada a técnica de western blot para avaliação do imunoconteúdo de ß-catenina, Nrf2 e HO-1 no hipocampo e o córtex pré-frontal nos animais tratados com este nucleosídeo. O tratamento combinado de guanosina (0,01 mg/kg, p.o.) e cloreto de lítio ou AR-A014418 produziu um efeito tipo-antidepressivo sinérgico no TSC. Da mesma forma, o efeito anti-imobilidade da guanosina (0,05 mg/kg, p.o.) foi completamente prevenido pelo tratamento com inibidores da MEK12 U0126 e PD98059 e com inibidor da HO -1 (ZnPP). Além disso, a administração de guanosina aumentou o imunoconteúdo de ß-catenina na fração nuclear e de Nrf2 na fração citosólica no hipocampo e córtex pré-frontal dos animais, além de aumentar o imunoconteúdo da HO-1 em ambas as estruturas. Levando em consideração que o efeito tipo-antidepressivo da guanosina envolve o bloqueio das respostas mediadas pelos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) e que o fortalecimento da função sináptica e das respostas antidepressivas envolve os receptores ácido alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiônico (AMPA) e NMDA, a segunda etapa deste estudo investigou se o efeito tipo-antidepressivo da guanosina no TSC envolve a modulação dos receptores AMPA, dos canais de cálcio dependentes de voltagem (CCDV), a ativação da via de sinalização fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) / TrkB e seus alvos de sinalização (P70S6K-Thr389), PSD-95 e sinapsina I. Na sequência foi investigado se a guanosina tem um efeito tipo-antidepressivo de longa duração (até 24 h) no TSC e se ela seria capaz de aumentar agudamente os níveis de BDNF no hipocampo e no córtex pré-frontal. Por fim, investigamos se o efeito da guanosina no teste da alimentação suprimida pela novidade (um paradigma comportamental responsivo apenas ao tratamento crônico com antidepressivos convencionais) está associado a alterações na densidade e morfologia dos espinhos dendríticos na porção ventral do giro denteado (GD) do hipocampo. Para avaliar o envolvimento dos receptores AMPA, dos CCVD e da via BDNF/TrkB no efeito tipo-antidepressivo da guanosina, os animais foram tratados com guanosina (0,05 mg/kg, p.o.) ou 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-diona (DNQX) (2,5 µg/sítio, i.c.v., antagonista de receptores AMPA/cainato), verapamil (10 mg/kg i.p.; bloqueador de CCDV), K252a (1 µg/sítio i.c.v., antagonista dos receptores TrkB) ou anticorpo anti-BDNF (1 µg/sítio i.c.v.) e foram posteriormente submetidos ao TSC e ao TCA. O imunoconteúdo de P70S6K, PSD-95 e sinapsina I foi avaliado no hipocampo e no córtex pré-frontal por western blot. O efeito tipo-antidepressivo da guanosina no TSC foi prevenido pela administração de DNQX, verapamil, anticorpo anti-BDNF e K-252a. Além disso, houve um aumento na fosforilação da P70S6K (Thr389) e no imunoconteúdo da sinapsina I 1 h após a administração da guanosina apenas no hipocampo. Não foram observadas alterações no imunoconteúdo de PSD-95 em ambas as estruturas. A guanosina apresentou um efeito tipo-antidepressivo no TSC 1 h, 6 h e 24 h horas após o tratamento, mas não alterou os parâmetros avaliados no TCA. Foi observado um aumento rápido e sustentado dos níveis de BDNF no hipocampo até 24 h após a administração de guanosina e um incremento rápido, mas não sustentado no córtex pré-frontal dos camundongos. Uma única administração de guanosina (0,05 mg/kg, p.o, 1 h antes) e de cetamina (1 mg/kg, i.p., 30 min antes) causou uma rápida resposta comportamental no teste da alimentação suprimida pela novidade, porém estes efeitos comportamentais não foram acompanhados por um aumento na densidade e remodelação dos espinhos dendríticos no GD da região ventral do hipocampo. Em conjunto, os dados reforçam as propriedades benéficas da guanosina e sugerem que este nucleosídeo pode ser um composto terapêutico promissor que deve ser investigado em humanos para o tratamento da depressão.

Abstract: Major depressive disorder (MDD) is a prevalent psychiatric disorder often associated with high morbidity and mortality. The MDD pharmacotherapy has limited efficacy and causes several side effects and delayed therapeutic response. Thus, the search for new therapeutic agents that promote a faster and more effective response without causing so deleterious effects is necessary. Guanosine, an endogenous nucleoside that has antidepressant-and neuroprotective properties was investigated in the present study. The aim of this work was to investigate the mechanisms underlying the antidepressant-like effects of guanosine and the morphological alterations associated with this effect. First, to investigate the involvement of the glycogen synthase kinase-3 (GSK-3ß) / protein kinase kinase (MEK 1/2) and nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) / heme oxygenase-1 (HO-1) signaling pathways in the guanosine antidepressant-like effect, mice were treated with guanosine combined with lithium chloride (a non-selective GSK-3ß inhibitor, 10 mg/kg, p.o.), AR-A014418 (GSK-3ß selective inhibitor, 0.01 µg/site, icv), U0126 (MEK1/2 inhibitor 5 µg/site, i.c.v.), PD98059 (MEK1/2 inhibitor 5 µg/site, i.c.v.) or zinc protoporphyrin (ZnPP) (HO-1 inhibitor, 10 µg/site, i.c.v.). Western blot was performed to evaluate the immunocontent of ß-catenin, Nrf2 and HO-1 in the hippocampus and prefrontal cortex. The combined treatment with sub-effective doses of guanosine (0.01 mg/kg, p.o.) and lithium chloride or AR-A014418 produced a synergistic antidepressant-like effect in the tail suspension test (TST). The antidepressant-like effect of guanosine (0.05 mg/kg, p.o.) was completely prevented by the treatment with MEK1/2 inhibitors U0126 and PD98059 or ZnPP. Guanosine administration (0.05 mg/kg, p.o.) increased the immunocontent of ß-catenin in the nuclear fraction and Nrf2 in the cytosolic fraction in the hippocampus and prefrontal cortex. The immunocontent of HO-1 was also increased in both structures. A second set of experiments investigated whether the antidepressant-like effect of guanosine in the TSC involves the modulation of a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, L-type voltage-dependent calcium channels (VDCC), activation of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/ tropomyosin receptor kinase B (TrkB) signaling pathway and its signaling targets (P70S6K [Thr389]), PSD-95, and synapsin I). We also sought to investigate whether guanosine has a long-lasting (up to 24 h) antidepressant-like effect in the TSC and whether it would be able to acutely increase BDNF levels in the hippocampus and prefrontal cortex. Finally, we aimed to investigate whether the effect of guanosine in the novelty suppressed feeding (NSF) test (a behavioral paradigm responsive only to chronic treatment with conventional antidepressants) is associated with changes in the density and morphology of the dendritic spines in the ventral portion of the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. To verify the involvement of AMPA receptors, VDCC, and BDNF/TrkB signaling in antidepressant-like effect by guanosine mice were treated with a guanosine (0.5 mg/kg, p.o.), 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (DNQX) (AMPA receptor antagonist, 2.5 µg/site, i.c.v.), K-252a (TrkB receptor antagonist, 1 µg/site, i.c.v.), or anti-BDNF antibody (1 µg/site, i.c.v.) before being subjected to TST and OFT. Then the P70S6K phosphorylation and the immunocontent of PSD-95 and synapsin I were evaluated by western blot in the hippocampus and prefrontal cortex. The antidepressant-like effect of guanosine was prevented by the administration of DNQX, verapamil, K-252a and BDNF antibody. Guanosine also increased P70S6K phosphorylation and the immunocontent of synapsin I only in the hippocampus 1h after its administration. Moreover, PSD-95 immunocontent was not altered in both structures. In another set of experiments, to evaluate if guanosine has a long-lasting antidepressant effect (up to 24 h), mice were subjected to the TST 1 h, 6 h and 24 h after guanosine treatment (0.05 mg/kg, p.o.). In addition, BDNF levels were measured in the hippocampus and prefrontal cortex. The results showed that guanosine exerts an antidepressant-like effect in the TST 1 h, 6 h and 24 h after its administration, but it did not alter any parameter in the open fiel test (OFT). Additionally, guanosine treatment increased BDNF levels in the hippocampus of mice 1, 6 and 24 h after its administration, whereas BDNF levels were increased only after 1 h in the prefrontal cortex. These results suggest that guanosine presents a long-lasting antidepressant-like effect up to 24 h after its administration, an effect associated with increased BDNF levels, especially in the hippocampus. Finally, the fast behavioral effect of guanosine (0.05 mg/kg, p.o., 1 h before) and ketamine (1 mg/kg, i.p., 30 min before) in the NSF test was not accompanied by alterations in dendritic spines in the ventral DG of the hippocampus. In general, the results elucidate signaling pathways involved in the antidepressant-like effect of guanosine and reinforce the role of these molecular targets for antidepressant responses, suggesting that this nucleoside can be a promising therapeutic compound that should be further investigated in humans for the treatment of MDD.