Efeito antitumoral do N-benzil-2-nitro-1-imidazol-acetamida (Benzonidazol) e possíveis mecanismos de ação

Abstract

O N-benzil-2-nitro-1-imidazol-acetamida (Benzonidazol, BZN) é um antiparasitário utilizado para o tratamento da doença de Chagas. Durante a biotransformação do BZN pelo CYP450 ocorre a geração de radicais livres que atuam sobre o DNA, proteínas e lipídeos produzindo danos oxidativos. Por outro lado, a geração excessiva de radicais livres pode ativar os mecanismo de morte celular por apoptose. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antitumoral de BZN utilizando o modelo in vivo de tumor ascítico de Ehrlich (TAE) com camundongos BALB/c, além da predição computacional vislumbrando compreender o mecanismo de interação entre BZN e o DNA e a proteína Akt1. BALB/c foram tratados (i.p.) com BZN (10mg/kg/dia), BZN+NAC (10mg/kg/dia+200mg/kg/dia) ou NAC (200mg/kg/dia) por 9 dias consecutivos. Posteriormente foram avaliados sobrevida, inibição do crescimento tumoral, angiogênese, tipo de morte celular e ciclo celular. O estresse oxidativo e defesa antioxidante foram avaliados através da mensuração do conteúdo de TBARS e GSH, dano ao DNA, geração de ERO, influxo de cálcio e atividades da CAT, SOD, GPx, GST e GR. Imunoblotting foi utilizado para avaliar níveis de proteínas chaves no processo de morte celular, ciclo celular, adaptação metabólica, sobrevivência, sobretudo da via Akt/mTOR. Por fim, foi avaliado a infiltração leucocitária e a atividade da Mieloperoxidase (MPO). O BZN aumentou a sobrevida (42%) dos animais e inibiu a crescimento tumoral (79%) e angiogênese (2,8 vezes). Este antiparasitário também causou aumento no número de células em apoptose (232%) e níveis das proteínas apoptóticas p53 e BAX. Tais efeito possivelmente estão associados a maior geração de ERO (42%), influxo de cálcio (55%), conteúdo de TBARS (1,9 vezes) alem das atividades da SOD (4,4 vezes), GPx (17,5 vezes), GST (3 vezes) e depleção de GSH (2,5 vezes). BZN causou danos ao DNA (7,6 vezes) resultando em aumento dos níveis de ?H2AX, além de promover a clivagem da PARP-1. Tambem causou maior aprisionamento das celulas na fase G, redução de níveis de ciclina A e aumento de CDK2. Proteínas chave da via da Akt/mTOR sofreram modulação por BZN por redução da fosforilação da Akt1 e mTOR1 e consequentemente redução dos níveis de HIF-1a (65%) e GLUT-1 (76%). Estes resultados estão em acordo com simulação in silico (docking molecular/dinâmica molecular), onde são indicadas interações BZN-DNA que favorece o dano ao DNA além da interação com a proteína Akt1 no sitio de fosforilação modulando a via Akt/mTOR. Por fim, análise histológica mostrou aumento do infiltrado leucocitário e redução da atividade da MPO (59%) sugerindo um efeito imunomodulatorio do BZN. Portanto BZN demonstrou ser um agente indutor de ERO, causando dano ao DNA e interagindo com a proteína Akt1 reduzindo sua ativação por fosforilação e conseuquentemente mTOR1. Neste contexto o benzonidazol surge como uma possibilidade de reposicionamento farmacológico visando uma potencial indicação terapêutica para o tratamento do câncer.

Abstract: N-benzil-2-nitro-1-imidazol-acetamida (Benzonidazole, BZN) is a antiparasitic drug used for the treatment of Chagas' disease. During the biotransformation of BZN by CYP450 occurs the generation of free radicals that act on the DNA, proteins and lipids producing oxidative damages. On the other hand, the excessive generation of free radicals can activate the mechanisms of cell death by apoptosis. The objective of this work was to evaluate the antitumor potential of BZN using the in vivo model of Ehrlich ascites tumor (TAE) with BALB / c mice, in addition to the computational prediction, understanding the mechanism of interaction between BZN and DNA and Akt1 protein. BALB/c were treated (i.p.) with BZN (10mg/kg/day), BZN + NAC (10 mg/kg/day + 200 mg/kg/day) or NAC (200 mg/kg/day) for 9 consecutive days. Subsequently, survival, inhibition of tumor growth, angiogenesis, type of cell death and cell cycle were evaluated. Oxidative stress and antioxidant defense were evaluated by measuring the content of TBARS and GSH, DNA damage, ROS generation, calcium influx and CAT, SOD, GPx, GST and GR activities. Immunoblotting was used to evaluate key protein levels in the process of cell death, cell cycle, metabolic adaptation, survival, mainly of the Akt/mTOR pathway. Finally, leukocyte infiltration and Mieloperoxidase activity (MPO) were evaluated. BZN increased survival (42%) of the animals and inhibited tumor growth (79%) and angiogenesis (2.8-fold). This anti-parasitic also caused an increase in the number of cells in apoptosis (232%) and levels of the apoptotic proteins p53 and BAX. These effects are possibly associated with higher generation of ROS (42%), calcium influx (55%), TBARS content (1.9-fold) and SOD activities (4.4-fold), GPx (17.5-fold), GST (3-fold) and GSH depletion (2.5-fold). BZN caused DNA damage (7.6-fold) resulting in increased levels of ?HßAX, in addition to promoting the cleavage of PARP-1. It also caused greater cell entrapment in the G-phase, reduction of cyclin A levels and increase of CDK2. Key Akt/mTOR pathway proteins were modulated by BZN by reducing the phosphorylation of Akt1 and mTOR and consequently reduced levels of HIF-1a (65%) and GLUT-1 (76%). These results are in agreement with in silico (molecular docking) simulation, where BZN-DNA interactions are indicated that favors DNA damage in addition to interaction with the Akt1 protein at the phosphorylation site modulating the Akt/mTOR pathway. Finally, histological analysis showed increased leukocyte infiltrate and reduced MPO activity (59%) suggesting an immunomodulatory effect of BZN. Therefore BZN has been shown to be an ERO-inducing agent, causing DNA damage and interacting with the Akt1 protein by reducing its activation by phosphorylation and mTOR1. In this context benzonidazole appears as a possibility of pharmacological repositioning aiming at a potential therapeutic indication for the treatment of cancer.