Efeito agudo in vivo e in vitro do bis(2-etilhexil)ftalato na homeostase do cálcio, metabolismo energético e estresse oxidativo em testículos de Danio rerio

Abstract

Os animais estão expostos a produtos químicos considerados desreguladores endócrinos (EDC) através da contaminação dérmica, ingestão ou inalação. O bis(2-etilhexil)ftalato, conhecido como BEHP ou DEHP é considerado um dos principais EDC e se destaca por afetar negativamente a bioquímica testicular de diferentes espécies animais, impactando na fisiologia reprodutiva e na fertilidade masculina. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito agudo in vivo e in vitro do BEHP na homeostase do cálcio (Ca2+), metabolismo energético e no estresse oxidativo em testículos de Danio rerio (D. rerio). Para estudar o impacto de diferentes molaridades de Ca2+ em testículos de D. rerio, os peixes foram mantidos em ambiente aquático por 12 h com uma baixa (0,02 mM) e alta (2 mM) concentração de Ca2+. Posteriormente, foi estudado o influxo de Ca2+ in vitro aos 30 e 60 min com Ca2+ radioativo (45Ca2+), bem como a atividade enzimática da transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) e transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) no fígado. Para o estudo do efeito do BEHP no D. rerio, os testículos foram tratados in vitro por 30 min e os peixes tratados in vivo por 12 h com BEHP a 1 µ?. Após os tratamentos, foram analisados o influxo de 45Ca2+, o envolvimento de canais iônicos, receptores e enzimas, conteúdo de lactato, atividade da lactato desidrogenase (LDH) e gama glutamil transpeptidase (GGT), bem como, a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e peroxidação lipídica em testículo de D. rerio. Adicionalmente, foi analisada a atividade da TGO e TGP no fígado. A modificação iônica com baixa (0,02 mM) e alta (2 mM) concentração de Ca2+ no ambiente aquático estimulou o influxo de Ca2+ no testículo, bem como acarretou em um aumento da atividade da TGP e GGT. Além disso, o efeito agudo in vitro de BEHP em uma baixa concentração aumentou o influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L, ativação do trocador Na+/Ca2+ (NCX) do modo reverso e inibição da Ca2+ ATPase SERCA; também acarretou na redução do conteúdo de lactato e redução da atividade da LDH no testículo. Além disso, o efeito agudo in vitro e in vivo do BEHP foi capaz de aumentar a produção de EROs e peroxidação lipídica no testículo. O efeito in vivo do BEHP também causou aumento da atividade da GGT no testículo e TGP no fígado de D. rerio. O efeito agudo do BEHP alterou negativamente a bioquímica testicular de peixes, acarretou em alteração da homeostase do Ca2+, redução do suporte energético e promoveu estresse oxidativo no testículo de D. rerio.

Abstract : The animals are exposed to chemicals that are considered endocrine disrupters (EDC) through dermal contamination, ingestion or inhalation. The bis (2-ethylhexyl) phthalate, known as BEHP or DEHP is considered one of the main EDC and it is known to affect negatively the testicular biochemistry of different animal species impacting on reproductive physiology and male fertility. Therefore, the objective of the present study was to evaluate the in vivo and in vitro acute effect of BEHP on calcium (Ca2+) homeostasis, energetic metabolism and oxidative stress in Danio rerio (D. rerio) testis. In order to study the impact of different Ca2+ molarities on D. rerio testis, the fish were kept in the aquatic environment for 12 h with a low (0.02 mM) and high (2 mM) Ca2+ concentrations. After, it was studied the Ca2+ influx at 30 and 60 min with radioactive Ca2+ (45Ca2+), as well as the enzymatic activity of glutamic-oxalacetic transaminase (GOT) and glutamic-pyruvic transaminase (GPT) in the liver. For the study of the effect of BEHP on D. rerio, the testis were treated in vitro for 30 min and the fish treated in vivo for 12 h with 1 µM of BEHP. After this, were studied the 45Ca2+ influx, the involvement of ionic channels, receptors and enzymes, lactate content, lactate dehydrogenase (LDH) and gamma and gamma glutamyl transpeptidase (GGT) activity, as well as production of reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxidation in the testis. In addition, the activity of GOT and GPT was analyzed in the liver. Ionic modification with low (0.02 mM) and high (2 mM) Ca2+ concentrations in the aquatic environment stimulated the Ca2+ influx in the testis, as well as resulted in an increase in GPT and GGT activity. In addition, the acute in vitro effect of BEHP at a low concentration increased Ca2+ influx through L-type voltage-dependent Ca2+ channels, activation of reverse-mode of Na+/Ca2+ (NCX) exchanger and Ca2+ ATPase SERCA inhibition; also led to the reduction of lactate content and reduction of LDH activity in the testis. In addition, the acute in vitro and in vivo effect of BEHP was able to increase ROS production and lipid peroxidation in the testis. The in vivo effect of BEHP also increased of GGT activity in the testis and GPT activity in the liver of D. rerio. The acute effect of BEHP was able to negatively alter the testicular biochemistry of fish, leading to alteration of Ca2+ homeostasis, reduction of energy support and promoting oxidative stress in the testis of D. rerio.