Unveiling chemical and biological profiles of plant-fermented kombucha culture through metabolomic studies using LCMS data assisted by MS databases

Abstract

A bebida kombucha é um mercado crescente de alimentos funcionais, produzida por uma cultura simbiótica de bactérias e leveduras (SCOBY) que fermentam chás adoçados de Camellia sinensis, entre outros substratos. É notável na literatura a escassez de estudos avaliando as respostas químicas dos microrganismos do kombucha quando expostos a plantas. A fim de compreender as transformações relacionadas ao tempo dentro de um ambiente de estudo, como a interação do kombucha com substratos, a metabolômica não direcionada pode ser aplicada. A técnica associa sistemas de separação e detecção, gerando um denso conjunto de dados. O tratamento destes dados assistido por ferramentas computacionais que suportam anotação estrutural in silico ? auxiliados por algoritmos ? podem contribuir com a identificação de perfis metabolômicos e sua posterior correlação em estudos de atividade biológica, bioprospecção de compostos ativos, assim contribuir com o desenvolvimento e valorização do produto comercial. Objetivos O presente estudo teve como objetivo estabelecer correlações metaboloma-microbioma após a fermentação de extratos vegetais não convencionais com cultura de kombucha, aplicando software e plataformas para caracterização e o impacto da fermentação em diferentes atividades biológicas. A avaliação de dependência do tempo foi investigada em amostras de kombucha (coração de banana, suco de uva e chá preto), bem como seu impacto nos efeitos antioxidantes e inibitórios da a-glucosidase. Bioprospecção de compostos bioativos em extratos fermentados e não fermentados de suco de uva utilizando metodologia bio-guiada de inibição enzimática contra proteases envolvidas em doenças infecciosas. Metodologia Extratos foram obtidos de coração de banana (infusão e hidroalcoólico), chá preto e suco de uva, inoculados com cultura de kombucha e submetidos a fermentação aeróbica à temperatura ambiente ao longo de 7, 14 e 21 dias. A fermentação foi interrompida com solvente orgânico (n-butanol), os extratos obtidos foram secos e armazenados em baixa temperatura até análise por UPLC-ESI-MS. O mesmo procedimento de extração e armazenamento foi efetuado para amostras não fermentadas. Os dados de UPLC-ESI-MS foram obtidos em modos de aquisição dependente (DDA) e independente (MSE), posteriormente utilizados para a construção de redes moleculares GNPS, e anotação assistida por MS-DIAL e MS-FINDER para a identificação do perfil químico das amostras. Os extratos foram submetidos a ensaios biológicos em placas de 96 poços utilizando-se substratos fluorogênicos (proteases) e cromogênicos (DPPH, a-glucosidase). Cromatografia flash, caracterizações espectrométricas (HRMS) e espectroscópicas (RMN 1H e 13C) foram utilizadas em estudo bioguiado em extratos fermentados de suco de uva contra proteases de cisteína e serina associadas a doenças infecciosas. Resultados e discussão Respostas químicas microbianas de hidrólise enzimática, oxidação e biossíntese foram identificadas, sendo a biossíntese diferente entre as amostras. Os esfingolipídios, safingol e cedefingol juntamente com capriloil glicina e palmitoil prolina foram identificados. Em suco de uva fermentado, foram detectados produtos de degradação de açúcar e transformação química juntamente com três hopanóides de membrana celular. Extratos fermentados de flor de bananeira apresentaram a presença de metil (?6 ou ?11)-hidroxibacteriohopanetetrol ciclitol juntamente com esfingofungina B, esfinganina e outros derivados de ácidos graxos. As atividades anti-hiperglicêmicas por inibição da a-glicosidase variaram de 20.7 a 46.5% para extratos de chá preto (exceto para extrato fermentado de chá preto de 14 dias). Demais amostras foram menos ativas que a acarbose. O extrato de chá preto fermentado por 21 dias apresentou propriedades antioxidantes moderadas (DPPH) com CE50 de 5,29 ± 0,10 µg mL-1, enquanto os demais extratos foram fracamente ativos (CE50 80,76 - 168,12 µg mL-1). Estudo bioguiado com 0,5 mg mL-1 de extrato de suco de uva contra proteases cisteína e serina mostrou maior inibição de L14D contra ZIKV (IC50 81 ± 6 µg mL-1) e extrato NF contra Catepsina L (73,02 ± 0,00%) e ZIKV (81,27±0,72%). A cromatografia flash levou ao isolamento de uma fração ativa do extrato do Biofilme, que foi caracterizada por RMN e HRMS, ainda a ser elucidada estruturalmente. A inibição não competitiva do composto foi identificada em estudos cinéticos contra protease serina do ZIKV com IC50 15,16 ± 1,09 µM. Conclusões e perspectivas A depender do substrato utilizado na fermentação, diferentes perfis químicos foram identificados, metabólitos foram atribuídos como respostas microbianas e possível impacto no efeito anti-hiperglicêmico e antioxidante. O potencial da kombucha na biossíntese de inibidores enzimáticos foi investigado no estudo bioguiado contra proteases de cisteína e serina, levando ao isolamento de um composto ativo contra protease de serina ZIKV. Ao longo do presente trabalho, as transformações químicas relacionadas ao tempo, bem como as respostas microbianas, aplicações biológicas e o potencial da fermentação da kombucha na geração de novas biomoléculas foram investigados. A elucidação estrutural do composto isolado contribuirá na compreensão do potencial de biossíntese da cultura, para o desenvolvimento de metodologias tendo como alvo a prospecção de inibidores, assim como a investigação de substratos que visem a produção destas moléculas.

Abstract: Kombucha beverage is a growing market of functional food, it?s produced by a symbiotic culture of bacteria and yeasts (SCOBY) which ferment sweentened Camellia sinensis teas, among other substrates. The lack of studies evaluating the chemical responses of kombucha microorganisms when exposed to plants is notable in the literature. Therefore, this work investigates the chemical behaviour of 7-, 14- and 21 day-fermentation of kombucha derived from three extracts obtained from banana inflorescence, black tea, and grape juice. After the acquisition of UPLC-ESI-MS data, GNPS molecular networking, MS-DIAL, and MS-FINDER were used to chemically characterize the samples. The microbial chemical responses were enzymatic hydrolysis, oxidation, and biosynthesis. The biosynthesis was different among the kombucha samples. The sphingolipids, safingol and cedefingol alongside capryloyl glycine and palmitoyl proline were identified. In fermented grapes, sugar degradation and chemical transformation products were detected together with three cell membrane hopanoids characterized as hydroxybacteriohopanetetrol cyclitol ether, (?6 or ?11)-hydroxybacteriohopanetetrol cyclitol ether, and methyl (?6 or ?11)-hydroxybacterio-hopanetetrol cyclitol. The fermented banana blossom showed the presence of methyl (?6 or ?11)-hydroxybacteriohopanetetrol cyclitol together with sphingofungin B, sphinganine and other fatty acid derivatives. Antihyperglicemic activities by inhibition of a-glucosidase ranged from 20.7 to 46.5% for black tea extracts (exception for 14-day black tea fermented extract). A 14-day fermented extract of the banana blossom infusion showed an inhibition of 29.1%, while grape samples were less active than acarbose. The 21-day fermented black tea extract showed moderate antioxidant properties on a DPPH-based model with an EC50 of 5.29 ± 0.10 µg mL-1, while the other extracts were weakly active (EC50 between 80.76 and 168.12 µg mL-1). Bio-guided study with 0.5 mg mL-1 of grape juice extracts against cysteine and serine proteases showed greater inhibition for L14D against ZIKV (IC50 81 ± 6 µg mL-1) and NF extract against Cathepsin L (73.02 ± 0.00%) and ZIKV (81.27 ± 0. 72%). Flash chromatography led to the isolation of an active fraction from the Biofilm extract, which was characterized by NMR and HRMS, to be structurally elucidated. Non-competitive inhibition of the compound was identified in kinetic studies of the ZIKV serine protease with IC50 15.16 ± 1.09 µM. The time-related chemical transformations as well as microbial responses, biological applications and potential of kombucha fermentation in generating new biomolecules was fully explored throughout the present work.