Planejamento, síntese e caracterização de plataformas nanoestruturadas para aplicação em terapia fotodinâmica e terapia fototérmica

Abstract

Na busca por novas tecnologias no universo dos nanomateriais empregados no tratamento de câncer, esta Tese reporta a síntese e caracterização de duas plataformas nanoestruturadas incorporadas com moléculas fotossensíveis, capazes de serem empregadas nas Terapias Fototérmica e Fotodinâmica para o tratamento de câncer de mama e câncer de pele melanoma. Apesar das numerosas vantagens que as fototerapias apresentam no tratamento de câncer, sua aplicação clínica ainda é pouco difundida devido à dificuldade no desenvolvimento de sistemas de liberação capazes de entregar o fotossensibilizador (FS) ao tecido alvo, sem detrimento de suas propriedades fotoquímicas. A primeira estratégia consistiu na aplicação de nanopartículas de ouro (AuNPs) recobertas com uma camada polimérica catiônica de N-(2-hidroxi)propil-3-trimetilamônio quitosana (HTCC), capazes de incorporar o FS azul de metileno (AM) e viabilizar sua aplicação biológica. O conjugado HTCC-AM-AuNPs, formado a partir de interações eletrostáticas entre seus componentes, apresentou morfologia esférica, tamanho compatível com direcionamento passivo (150 nm) e um potencial Zeta de superfície catiônico (+26 mV), que seria capaz de promover uma maior interação material-células. Ao absorver radiação na região do vermelho (660 nm, 100 mW cm-2) o conjugado demonstrou capacidade de produção de EROs, ainda que em menor proporção em relação ao AM livre, dentre elas oxigênio singleto (1O2) e radical hidroxia (?OH). Além disso, observou-se uma redução da fotooxidação do AM conjugado, e o efeito foi associado à fotoproteção conferida pela camada polimérica (HTCC) de revestimento. Análises de lentes térmicas revelaram que o conjugado é capaz de converter cerca de 25% da energia absorvida em calor. Os testes biológicos in vitro contra células de câncer de mama MDA-MB231, na presença de luz, revelaram maior efeito citotóxico de HTCC-AM-AuNPs em relação ao AM livre, apesar de sua menor capacidade de geração de espécies citotóxicas, o que aponta para um efeito sinérgico (fotodinâmico e fototérmico) proporcionado por TFT e TFD. No escuro, o conjugado proporcionou uma redução significativa da toxicidade do AM. A segunda estratégia proposta nesta Tese consistiu na síntese de um complexo polieletrolítico (CPE) a partir da combinação entre o policátion BioTMC (N,N,N-Trimetil quitosana biotinilada) e o poliânion PAIm-12 (poli ácido acrílico funcionalizado com imidazol), para incorporação do FS Ftalocianina de Zinco II (ZnPc), originando o CPE PAIm-12-ZnPc-BioTMC. Espectros de absorção de luz UV-Vis e de emissão de fluorescência comprovaram a presença de ZnPc na forma monomérica incorporada ao CPE. Além disso, as alterações reportadas nos espectros de FT-IR para a ZnPc conjugada ao CPE são indicativos de uma coordenação axial do Zinco com os grupos carboxilato do PAIm-12. Investigações fotoquímicas empregando ácido 9,10-antracenodiil-bis(metileno)dimalônico (ABDA) e luz vermelha (660 nm, 100 mW cm-2) revelaram a capacidade de formação de EROs pela ZnPc em sua forma livre e conjugada, sendo que na forma livre em etanol foram observados modelos cinéticos de fotodegradação de primeira ordem, enquanto que no CPE os modelos observados foram aqueles de duas etapas consecutivas de primeira ordem. Nos testes biológicos in vitro contra células de câncer de pele melanoma B16F10, o CPE reduziu a citotoxicidade no escuro da ZnPc, apresentando-se atóxico até a concentração de 2x10-6 M. Na presença de luz branca (55,3 J cm-2), o CPE foi capaz de promover a inativação de cerca de 55% das células de melanoma em uma única aplicação. Em suma, os sistemas propostos foram capazes de encapsular os FS, proporcionando fotoproteção e manutenção de suas propriedades físico-químicas e fotodinâmicas, viabilizando estudos futuros para aplicação biológica in vivo.

Abstract: In the quest for new technologies in the universe of nanomaterials used in cancer treatment, this Thesis reports the synthesis and characterization of two nanostructured platforms incorporated with photosensitive molecules, capable of being used in Photothermal and Photodynamic Therapies for the treatment of breast cancer and melanoma skin cancer. Despite the numerous advantages that phototherapies offer in cancer treatment, their clinical application is still limited due to the challenge in developing delivery systems capable of delivering the photosensitizer (PS) to the target tissue without compromising its photochemical properties. The first strategy involved the application of gold nanoparticles (AuNPs) coated with a cationic polymeric layer of N-(2-hydroxy)propyl-3-trimethylammonium chitosan (HTCC), capable of incorporating the PS methylene blue (MB) and then enabling its biological application. The HTCC-MB-AuNPs conjugate, formed from electrostatic interactions between its components, presented a spherical morphology, a size compatible with passive targeting (150 nm), and a cationic surface Zeta potential (+26 mV), which could promote a greater material-cell interaction. Upon absorbing radiation in the red region (660 nm, 100 mW cm-2), the conjugate demonstrated the ability to produce ROS, although in a smaller proportion compared to free MB, including singlet oxygen (1O2) and hydroxyl radical (?OH). Additionally, a reduction in the photo-oxidation of the MB was observed when conjugated to the system, and this effect was associated with the photoprotection conferred by the polymeric (HTCC) coating layer. Thermal lens analyses revealed that the conjugate is capable of converting about 25% of the absorbed energy into heat. In vitro biological tests against MDA-MB231 breast cancer cells, in the presence of light,revealed a higher cytotoxic effect of HTCC-MB-AuNPs compared to free MB, despite its lower capacity to generate cytotoxic species, indicating a synergistic effect (photodynamic and photothermal) provided by PTT and PDT. In the dark, the conjugate significantly reduced the toxicity of MB. The second strategy proposed in this Thesis involved the synthesis of a polyelectrolyte complex (PEC) from the combination of the polycation BioTMC (N,N,NTrimethyl biotinylated chitosan) and the polyanion PAIm-12 (imidazole-functionalized polyacrylic acid), to incorporate the PS Zinc Phthalocyanine II (ZnPc), resulting in the PEC PAIm-12-ZnPc-BioTMC. UV-Vis light absorption spectra and fluorescence emission spectra confirmed the presence of ZnPc in the monomeric form incorporated into the PEC. Moreover, the alterations reported in the FT-IR spectra for ZnPc conjugated to the PEC, indicate an axial coordination of Zinc with the carboxylate groups of the PAIm-12. Photochemical investigations employing 9,10-anthracenediyl-bis(methylene)dimalonic acid (ABDA) and red light (660 nm, 100 mW cm-2) revealed the ROS formation capability by ZnPc in its free and conjugated forms, with first-order photodegradation kinetics observed in the free form in ethanol, while in the PEC, the observed models were those of two consecutive first-order steps. In vitro biological tests against B16F10 melanoma skin cancer cells showed that the PEC reduced the dark cytotoxicity of ZnPc, presenting non-toxicity up to a concentration of 2µM. In the presence of white light (55.3 J cm-2), the PEC was able to promote the inactivation of about 55% of the melanoma cells in a single application. In summary, the proposed systems were able to encapsulate the PS, providing photoprotection and maintaining their physicochemical and photodynamic properties, enabling future studies for in vivo biological applications.