Tiorredoxina redutase-1 como possível biomarcador e alvo terapêutico no câncer de pulmão de células não pequenas: uma análise pré-clínica e clínica da ativação da via NRF2 e recorrência tumoral

Abstract

As mutações de ativação na via KEAP1/NRF2 caracterizam um subconjunto de carcinoma de pulmão de células não pequenas (CPCNP) associado a quimiorresistência e mau prognóstico. Nesta tese, avaliamos a relação entre 64 genes relacionados ao estresse oxidativo e dados de sobrevida global de 35 coortes de câncer de pulmão. Dentre estes, a tiorredoxina redutase-1 (TXNRD1) se destacou como o preditor mais significativo de menor sobrevida global. Em uma coorte hospitalar de 65 pacientes com CPCNP, observou-se que os níveis elevados da proteína TXNRD1 em imunohistoquímica (IHC) se correlacionaram com menores tempos de sobrevida livre de doença e sobrevida livre de metástase distal após a cirurgia, um padrão também foi observado em um subgrupo de indivíduos tratados com quimioterapia adjuvante à base de compostos de platina. Análises de bioinformática revelaram que os tumores CPCNP com alterações genéticas na via NRF2 (mutações em KEAP1, NFE2L2 e CUL3, e amplificação NFE2L2) superexpressam TXNRD1, enquanto nenhuma associação entre a expressão de TXNRD1 e mutações em EGFR, KRAS, TP53 e PIK3CA foi encontrada. De fato, por IHC, observou-se que o acúmulo nuclear de NRF2 está associado a altos níveis de TXNRD1 em CPCNP. Ensaios funcionais em linhagens celulares e análise de gene-dependência revelaram que NRF2, mas não TXNRD1, tem um papel central na sobrevivência das células mutantes KEAP1. Mutantes KEAP1 superexpressam TXNRD1 e são menos suscetíveis aos efeitos citotóxicos do inibidor de TXNRD1 auranofina quando comparados com linhagens celulares não-mutadas em KEAP1. A inibição de NRF2 com siRNA ou ML-385, e a depleção de glutationa (GSH) com butionina-sulfoximina, sensibilizou células A549 de CPCNP (mutantes KEAP1) para auranofina. O knockdown de NRF2 e a depleção de GSH aumentaram a citotoxicidade da cisplatina em células A549, enquanto a auranofina não teve efeito sobre a toxicidade do quimioterápico in vitro. Em resumo, esses achados sugerem que TXNRD1 não é um determinante chave de fenótipos malignos em células mutantes KEAP1, embora esta proteína possa ser um marcador indireto da ativação da via de NRF2, prevendo a recorrência do tumor e possivelmente outros fenótipos agressivos associados à hiperativação de NRF2 em CPCNP.

Abstract: Activating mutations in the KEAP1/NRF2 pathway characterize a subset of non-small cell lung cancer (NSCLC) associated with chemoresistance and poor prognosis. We herein evaluated the relationship between 64 oxidative stress-related genes and overall survival data from 35 lung cancer datasets. Thioredoxin reductase-1 (TXNRD1) stood out as the most significant predictor of poor outcome. In a cohort of NSCLC patients, high TXNRD1 protein levels correlated with shorter disease-free survival and distal metastasis-free survival post-surgery, including a subset of individuals treated with platinum-based adjuvant chemotherapy. Bioinformatics analysis revealed that NSCLC tumors harboring genetic alterations in the NRF2 pathway (KEAP1, NFE2L2 and CUL3 mutations, and NFE2L2 amplification) overexpress TXNRD1, while no association with EGFR, KRAS, TP53 and PIK3CA mutations was found. In addition, nuclear accumulation of NRF2 overlapped with upregulated TXNRD1 protein in NSCLC tumors. Functional cell assays and gene dependency analysis revealed that NRF2, but not TXNRD1, has a pivotal role in KEAP1 mutant cells? survival. KEAP1 mutants overexpress TXNRD1 and are less susceptible to the cytotoxic effects of the TXNRD1 inhibitor auranofin when compared to wild-type cell lines. Inhibition of NRF2 with siRNA or ML-385, and glutathione (GSH) depletion with buthionine-sulfoximine, sensitized KEAP1 mutant A549 cells to auranofin. NRF2 knockdown and GSH depletion also augmented cisplatin cytotoxicity in A549 cells, whereas auranofin had no effect. In summary, these findings suggest that TXNRD1 is not a key determinant of malignant phenotypes in KEAP1 mutant cells, although this protein can be a surrogate marker of NRF2 pathway activation, predicting tumor recurrence and possibly other aggressive phenotypes associated with NRF2 hyperactivation in NSCLC.