Quantificação e identificação de escherichia coli por multi cell differential scanning calorimetry (MCDSC)

Abstract

A microcalorimetria isotérmica (IMC) é uma técnica sensível que realiza medições de pequenas quantidades, em torno de 0,2 µW, de calor produzido. É uma análise térmica capaz de monitorar em tempo real, sob condições de temperatura constante, os processos metabólicos envolvidos no crescimento microbiano. Uma vez que, todo organismo vivo produz calor como resultado das reações metabólicas. Em IMC, os resultados gerados são os dados termocinéticos (watts por tempo) do crescimento de um microrganismo em uma condição específica. Atualmente, a IMC está difundida em análises clínicas e na identificação de patógenos, e tem potencial aplicação em diversas áreas como no controle de qualidade de alimentos. Contudo, alguns desafios circundam a ampliação do uso. Dentre eles, destacam-se o alto custo de aquisição de microcalorímetros, a não padronização de termos e nomenclaturas, bem como a dificuldade de transcrição dos dados calorimétricos para informações de importância biológica. Assim, a referida tese tem como objetivo avaliar a capacidade do MultiCell Differential Scanning Calorimetry (MCDSC), um calorímetro de varredura (DSC), capaz de operar em modo isotérmico, para a detecção de microrganismos. Primeiramente, foi realizada busca em literatura pertinente a fim de apanhar as informações disponíveis sobre o atual uso da técnica e referente à possibilidade de uso do MCDSC como alternativa aos instrumentos de IMC. Os estudos coletados indicaram necessidade de aprofundamento das metodologias utilizadas, tanto em relação à calorimetria quanto na microbiologia clássica. Ainda, observou-se o apelo para a padronização das informações e nomenclaturas pertinentes às curvas de fluxo de calor da extração dos parâmetros de crescimento calorimétrico, uma vez que não existe consenso. Toda a busca literária garantiu a elaboração de protocolo de ensaio seguro para avaliação do MCDSC na detecção de microrganismos. Para tanto, Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli) foi utilizada como microrganismo teste, uma vez que seu metabolismo é conhecido por diversos métodos microbiológicos, facilitando a comparação entre os dados. Os resultados calorimétricos obtidos foram comparados com os dados encontrados na literatura, com referência aos calorímetros mais sensíveis de IMC. Para, assim, verificar a sensibilidade do equipamento MCDSC na detecção de E. coli em diferentes concentrações, confrontando os dados calorimétricos com os dados obtidos por metodologias de cultivo tradicionais envolvendo a contagem em placas. Os dados de multiplicação celular, em todos os métodos de cultivo e mensura, foram comparados entre si com auxílio de modelo matemático de Baranyi e Roberts (BAR). O modelo sigmoide BAR é amplamente reconhecido em aplicações da microbiologia preditiva por ser capaz de descrever todas as fases que envolvem o crescimento microbiano. A partir do ajuste ? avaliado pelos parâmetros R2 (coeficiente de determinação) e RMSE (raiz quadrada do erro médio) ? adequado ao modelo, foram extraídos os parâmetros velocidade máxima específica de crescimento (????) e duração da fase lag (?) para E. coli no MCSDC e contagem em placas nas diferentes condições de cultivo. Os resultados para a ???? entre 0,799 e 1,143 (1/h) são semelhantes entre os cultivos estudados, bem como para o tipo de dado aos quais o modelo foi ajustado, porém, há distinção entre ? para os cultivos. O que pode ser explicado pela sensibilidade do calorímetro utilizado. Contudo, os resultados apontam que o MCDSC foi capaz de identificar diferenças na concentração do inóculo. Ainda, o equipamento foi adequado para obtenção do fingerprint para E. coli, de acordo com dados encontrados na literatura. Caracterizando o MCDSC e o protocolo de ensaio desenvolvido como potencial para detecção de E. coli, contribuído para promover o uso da calorimetria para medições microbiológicas.

Abstract: Isothermal microcalorimetry (IMC) is a sensitive technique that measures small amounts, around 0.2 µW, of produced heat. It is a thermal analysis capable of monitoring in real time, under conditions of constant temperature, the metabolic processes involved in microbial growth since every living organism produces heat because of metabolic reactions. In IMC, the results generated are the thermokinetic data (watts per time) of the growth of a microorganism in a specific condition. Currently, IMC is widespread in clinical analysis and identification of pathogens and has potential application in several areas such as food quality control. However, some challenges surround the expansion of use. Among them, we highlight the high cost of acquiring microcalorimeters, the non-standardization of terms and nomenclatures, as well as the difficulty in transcribing calorimetric data for the information of biological importance. Thus, the present study aims to evaluate the capacity of the MCDSC, a scanning calorimeter, capable of operating in isothermal mode, for detecting the presence of microorganisms. First, a search was carried out in the relevant literature to gather available information about the current use of the technique and regarding the possibility of using the MCDSC as an alternative to IMC instruments. The collected studies indicated the need to deepen the methodologies used, both in relation to calorimetry and classical microbiology. Still, there was a call for the standardization of information and nomenclatures related to the heat flow curves for the extraction of calorimetric growth parameters since there is no consensus. The entire literature search ensured the elaboration of a safe test protocol for evaluating the MCDSC in the detection of microorganisms. For this purpose, E. coli was used as a test microorganism, since its metabolism is well known by several microbiological methods, facilitating the comparison between data. The calorimetric results obtained were compared with existing data in the literature, with reference to the most sensitive calorimeters ? IMC. To verify the sensitivity of the MCDSC equipment in the detection of E. coli in different concentrations, comparing the calorimetric data with the data obtained by traditional cultivation methodologies that involve counting in plates. The growth data, in all cultivation and measurement methods, were compared with the aid of a mathematical model by Baranyi and Roberts (BAR). The BAR sigmoid model is widely recognized in predictive microbiology applications. Being able to describe all stages involving microbial growth. The BAR sigmoid model is widely recognized in predictive microbiology applications for being able to describe all phases involving microbial growth. From the adjustment - evaluated by the parameters ?2 and ???? - adequate to the model, the parameters maximum growth velocity (µ???) and duration of the lag phase (?) were extracted for E. coli in the MCSDC and plate count in the different cultivation conditions. The results for µ??? between 0.799 and 1.143 (1/h) are similar between the cultures studied, as well as for the type of data adjusted to the model, however, there is a distinction between ? for the cultures. This can be explained by the sensitivity of the calorimeter used in the present study. However, the results indicate that the MCDSC was able to identify differences in inoculum concentration. Furthermore, the equipment proved to be suitable for obtaining the fingerprint of E. coli, according to data found in the literature. Characterizing the MCDSC and the test protocol developed as potential for the detection of E. coli, promoting the use of calorimetry for microbiological measurements.