Caracterização funcional da proteína CHAP1 de Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas ou tripanosomíase americana é uma doença parasitária endêmica das Américas, sendo um grande problema de saúde nesta região. Esta doença tem com agente etiológico o Trypanosoma cruzi, protozoário parasita pertencente a ordem Kinetoplastida. O seu ciclo de vida envolve a passagem em um hospedeiro invertebrado e um hospedeiro mamífero. Para garantir o sucesso na infecção, este parasito possui um sistema antioxidante diferenciado e eficiente, capaz de suportar as respostas oxidativas e nitrosativas impostas pelos seus hospedeiros. Este sistema é baseado na molécula tripanotiona, um tiol de baixo peso molecular, composto por duas glutationas e uma espermidina. A biossíntese dessa molécula é dividida em duas etapas: a primeira etapa pode ser catalisada tanto pela enzima glutationilespermidina sintetase quanto pela enzima tripanotiona sintetase, onde ocorre a ligação de uma glutationa em uma espermidina, enquanto na segunda etapa ocorre a ligação da segunda glutationa a espermidina, mediada exclusivamente pela tripanotiona sintetase. Além de catalisar a síntese da tripanotiona através do domínio grasp, a tripanotiona sintetase tem a capacidade de catalisar a lise desta molécula condicionada pela presença de um domínio amidase, denominado domínio CHAP. No genoma do T. cruzi existem três genes anotados como tripanotiona sintetase. Entretanto, análises detalhadas destas sequências apontam que duas delas não apresentam o domínio de síntese, possuindo apenas o domínio CHAP, sendo então denominadas de CHAP1 e CHAP2, sugerindo uma função distinta da tripanotiona sintetase. Devido a tais circunstâncias, este trabalho tem o objetivo de caracterizar funcionalmente a proteína CHAP1 de T. cruzi. Para tal, a TcCHAP1 recombinante na forma nativa será purificada e utilizada em ensaios de atividade. Os níveis e sítios de expressão da TcCHAP1 nas diferentes formas do parasito serão analisados utilizado o antissoro anti-CHAP1 através de ensaios de western blot com extratos totais e extratos de frações celulares e imunofluorescência. Também será avaliada a essencialidade e funcionalidade da TcCHAP1 através da análise fenotípica dos parasitos diante da deleção (sistema CRISPR-Cas9) e superexpressão deste gene. Desta forma espera-se entender de forma mais clara o sistema antioxidante desses tripanosomatídeos, elucidando o papel biológico desta proteína no T. cruzi.