Análise do processo de regeneração de defeitos ósseos mandibulares de ratos com o uso de células da polpa de dentes permanentes humanos (hDPCs)

Abstract

Células da polpa dental humana (hDPCs) têm sido identificadas como uma população de células-tronco com multipotencial de diferenciação. Este trabalho teve como objetivo analisar o potencial das hDPCs em regenerar defeitos ósseos mandibulares de ratos e avaliar a marcação de progenitores de células da crista neural, HNK1 e Sox10, neste processo. Para examinar a eficácia destas células na regeneração óssea, foram isoladas células da polpa de dentes permanentes e enxertadas em defeitos ósseos mandibulares de ratos. Anteriormente às cirurgias, as hDPCs foram analisadas. As mesmas apresentaram: aderência ao plástico; expressão de CD105, CD90 e CD73 em mais de 95% da população e expressão de CD45 em menos de 2% da população; capacidade de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, sendo caracterizadas como células-tronco da polpa dental humana (hDPSCs). Para o protocolo cirúrgico, utilizou-se 9 ratos Wistar, machos, de aproximadamente 250 gramas que foram submetidos à confecção de um defeito ósseo no lado direito e esquerdo da mandíbula, medindo 1mm de altura/ profundidade e 3mm de comprimento, sob a coroa do primeiro molar inferior. No lado direito, grupo tratado, aplicou-se hDPCs, enquanto que no lado esquerdo, grupo controle, nenhum material foi aplicado. As hDPCs remanescentes do protocolo cirúrgico tiveram sua viabilidade analisada através do teste de MTS e ensaio de diferenciação osteogênica. Verificou-se que as células remanescentes estavam viáveis, sem haver diferença estatística significativa quando comparada ao grupo controle, e as mesmas mantiveram a capacidade de diferenciação osteogênica. Três animais de cada grupo foram eutanasiados no tempo de 7, 14 e 28 dias de pós-operatório. As amostras foram avaliadas por microscopia de luz (coloração de hematoxilina e eosina), a área de regeneração foi mensurada pelo programa Image J e a expressão dos marcadores, HNK1 e Sox10, foi avaliada através de imuno-histoquímica. Considerou-se valor de p<0,05 para dados com significância estatística. Os resultados indicaram que em 7 dias de pós-operatório o grupo controle apresentou pronunciada formação óssea quando comparado ao grupo tratado (p = 0,03). Aos 14 dias, o grupo tratado mostrou aumento na formação óssea, mas não houve diferença estatística significativa entre os grupos (p = 0,62). No período final de avaliação não houve diferença entre o grupo controle e o tratado (p = 0,89). Foi observada marcação moderada para HNK1 e Sox10 em osteoblastos e osteócitos em 7 dias, e intensa em 14 e 28 dias, sem diferença entre controle e tratado. Dentro dos padrões do presente estudo, pode-se concluir que, embora houve um rápido aumento na formação óssea entre 7 e 14 dias de pós-operatório com o uso das hDPCs, não há evidências de que o uso destas células beneficiou a formação óssea quando comparado ao grupo controle nos períodos analisados. HNK1 e o Sox10 estão presentes em osteoblastos e osteócitos em processo de regeneração.<br>

Abstract : Human dental pulp cells (hDPCs) have been identified as a stem cell population with multipotential differentiation capabilities. The aim of this study was to analyze the potential of hDPCs in regenerating mandibular bone defects of rats and to evaluate the immunoexpression of progenitors of neural crest cells, HNK1 and Sox10, in this process. To examine the efficacy of these stem cells in bone regeneration, we isolated human dental pulp cells from permanent teeth and engrafted in mandibular bone defects of rats. Prior to surgery procedures, the hDPCs were analyzed: plastic-adherent; > 95% expression of CD105, CD90 and CD73; < 2% expression of CD45; and differentiation into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts; and therefore characterized as human dental pulp stem cells (hDPSCs). Surgery procedures were performed in 9 male Wistar rats. The bone defect was prepared under the mandibular first molar, in the right and left mandible with 1mm of height/depth and 3mm length. On the right side, treated group, the hDPCs were applied, while on the left side, control group, no treatment was performed. The remaining hDPCs of the surgical protocol had their viability analyzed through the MTS test and osteogenic differentiation assay. The remaining cells were viable, without significant statistical difference when compared to the control group, and they maintained the capacity for osteogenic differentiation. Three animals of each group were euthanized at 7, 14 and 28 days post-surgery. Samples were evaluated by light microscopy (hematoxylin and eosin staining), the regeneration area was measured by Image J software and the presence of the markers HKN1 and Sox10 was evaluated by immunochemistry. A value of p <0.05 was considered for data with statistical significance. Results indicated that within 7 days, control group presented a pronounced bone formation when compared with the treated group (p = 0,03). In 14 days, the treated group showed an increase in bone formation, but with no statistical difference among groups (p = 0,62). At the final period evaluated there was no difference between both groups (p = 0,89). Moderate staining for HNK1 and Sox10 was observed in osteoblasts and new osteocytes at 7 days, and intense at 14 and 28 days, with no difference between control and treated groups. In conclusion, although there was a rapid increase in bone formation between 7 and 14 days with the use of hDPCs, with regard the methods used in this study, there is no evidence that the use of these cells improve bone formation in comparison to the control group during the periods analyzed. HNK1 and Sox10 are present in osteoblasts and osteocytes during the regeneration process.