Análise in silico de proteínas da zona de adesão flagelar e caracterização molecular da glicoproteína de adesão flagelar 3 (Fla3) de Trypanosoma rangeli e de Trypanosoma cruzi

Abstract

Os protozoários do gênero Trypanosoma possuem um único flagelo que emerge da bolsa flagelar e é aderido ao longo do corpo do parasito via zona de adesão flagelar (FAZ), sendo a extremidade do flagelo livre. A adesão é importante para a divisão celular, motilidade e infectividade do parasito. A FAZ de Trypanosoma brucei, agente etiológico da doença do sono no continente africano, é composta de ao menos 30 proteínas. Uma dessas é a Glicoproteína de Adesão Flagelar 3 (Fla3), proteína estágio específica expressa nas formas de corrente sanguínea do parasito. Diferente de T. brucei, pouco se sabe sobre a FAZ de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. Este trabalho teve como objetivo realizar a busca de proteínas ortólogas as proteínas da FAZ de T. brucei em T. cruzi e T. rangeli e caracterizar molecularmente a Fla3 destes dois parasitos. As sequências de 30 proteínas descritas na FAZ de T. brucei foram utilizadas para a busca de sequências ortólogas em T. cruzi e T. rangeli. Foram encontradas 25 proteínas ortólogas em ambas as espécies, o que indica uma redução no número de proteínas da FAZ. A sequência ortóloga a Fla3 em T. cruzi (TcFla3) e T. rangeli (TrFla3) é a mesma encontrada como ortóloga de outra proteína, Fla1BP, sendo esta expressa nas formas procíclicas de T. brucei. A TrFla3 é um gene de 2.214 pb, que corresponde a uma proteína de 737 aminoácidos com peso molecular previsto de 80,5 kDa. Visando a expressão heteróloga, a TrFla3 foi subclonada em vetor de expressão, que foi utilizado para transformar as linhagens bacterianas BL21 (DE3), BL21 (DE3) Codon Plus, BL21 (DE3) Rosetta e BL21 (DE3) pLysS com diferentes tempos e temperaturas de indução. Como não foi possível a expressão da ORF da TrFla3 nas condições testadas, um fragmento (TrFla3_Frag2) foi expresso na linhagem BL21 (DE3) Codon Plus. Este fragmento foi purificado e utilizado para a imunização de camundongos, sendo o soro obtido capaz de reconhecer o fragmento proteico recombinante (~ 24,67 kDa) e duas bandas de aproximadamente 100 e 250 kDa nos extratos de tripomastigotas e epimastigotas das cepas Choachí e SC58 de T. rangeli. Dessa forma, a TrFla3, ao contrário da TbFla3, não é estágio específica. Nenhuma proteína foi reconhecida nos extratos de tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) e promastigotas de Leishmania infantum, sugerindo que o antissoro anti-TrFla3 produzido é espécie específico. A diferença de peso molecular esperado (80,5 kDa) e observado (100 kDa) pode estar relacionada as modificações de glicosilação sofridas pós-tradução. Quanto a TcFla3, foi possível apenas a amplificação da ORF da cepa Y, que corresponde a um gene de 2.136 pb e a uma proteína de 712 aminoácidos com peso molecular de 79,73 kDa. Como não houve reconhecimento de anticorpos anti-TrFla3_Frag2 da TrFla3, fragmentos proteicos recombinantes da TcFla3 serão produzidos a fim de gerar anticorpos específicos. Ainda será necessário a realização de estudos de citolocalização e níveis de expressão para verificar se a Fla3 dessas duas espécies manteve as características da TbFla3.

The protozoa from the genus Trypanosoma possess a single flagellum which emerges from the flagellar pocket and it is attached to the cell body through the flagellar attachment zone (FAZ), being the extremity tip free. This adhesion is significant for cell division, motility and infectivity of the parasite. The FAZ from Trypanosoma brucei, etiological agent of the sleeping illness in the african continent, is composed of at least 30 proteins. One of them is the Flagellar Glycoprotein 3 (Fla3), which is a stage-specific protein expressed in the bloodstream forms. Meanwhile, little is known about the FAZ from Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. This study aims to search for orthologous proteins of FAZ proteins from T. brucei in T. cruzi and T. rangeli, and characterize the Fla3 from both parasites. The sequences from 30 FAZ proteins from T. brucei were used for searching orthologous sequences in T. cruzi e T. rangeli. We found 25 orthologous in each species, which indicates a reduction of the number of FAZ proteins in both of them. The orthologous sequence of Fla3 in T. cruzi e T. rangeli is also found as orthologous of another protein, Fla1BP, which is expressed in the procyclic forms of T. brucei. Fla3 from T. rangeli (TrFla3) is a gene of 2214 bp, which corresponds to a protein of 737 amino acids and a predicted molecular weight of 80,5 kDa. Aiming heterologous expression, TrFla3 was sub cloned in expression vector, which was used to transform the bacteria lineages BL21 (DE3), BL21 (DE3) Codon Plus, BL21 (DE3) Rosetta and BL21 (DE3) pLysS with different times and temperatures of induction. As it was not possible to express TrFla3 ORF under the tested conditions, a fragment (TrFla3_Frag2) was expressed in the lineage BL21 (DE3) Codon Plus. This recombinant fragment was purified and used to imunize mices. The serum containing antibodies anti-TrFla3_Frag2 was collected, and those antibodies recognized the recombinant peptide (approximately 24.76 kDa) and two other bands of approximately 100 and 250 kDa in the extracts of trypomastigotes and epimastigotes of Choachí and SC58 strains (T. rangeli), but it did not recognize T. cruzi neither Leishmania infantum. Therefore, the antibodies anti-TrFla3_Frag2 are species-specific. The TrFla3, unlike TbFla3, is not stage-specific. The difference between expected and observed molecular weight may be related to post-translational glycosylation. Regarding Fla3 from T. cruzi (TcFla3), we could only amplify the ORF from Y strain, which corresponds to a gene of 2136 bp and a protein of 712 amino acids with molecular weight of 79.73 kDa. Once antibodies anti-TrFla3_Frag2 did not recognize TcFla3, recombinant fragments of this protein will be produced with the purpose of producing specific antibodies anti-TcFla3. It will be necessary to realize studies of cytolocalization and expression levels to verify if Fla3 from both species still have the characteristics of TbFla3.