Desenvolvimento de uma metodologia molecular para detecção e triagem de patógenos com potencial zoonótico transmitidos pelo leite bovino

Abstract

O leite se destaca como importante produto do agronegócio catarinense e brasileiro por sua importância econômica e social. A globalização do mercado promoveu investimentos em produtividade e qualidade composicional, mas ainda há negligência para com a biosseguridade do leite como alimento. Na rotina da cadeia láctea não existe uma metodologia para identificação e triagem rápida de patógenos de importância em saúde pública e, os métodos tradicionais são laboriosos, demorados e pouco eficientes. Dados epidemiológicos sobre a circulação de agentes zoonóticos em rebanhos leiteiros são escassos, bem como informações sobre ocorrência de doenças transmitidas por alimentos (DTAs). Neste contexto, desenvolvemos e avaliamos um método analítico via PCR multiplex para detecção simultânea de seis patógenos com potencial zoonótico, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Brucella abortus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli e Salmonella spp., em leite. O método compreende uma etapa de concentração da amostra, posterior enriquecimento em cultura por 8 horas/ 37ºC, seguido de tratamento térmico para extração do DNA e amplificação de genes espécie específicos. O limite de detecção analítica do método proposto foi 100 fg de DNA genômico purificado por reação e 100 CFU.mL-1 em leite contaminado, exceto para B. abortus (104 CFU.mL-1). A comparação do método desenvolvido com testes de referência para o diagnóstico de cada patógeno, em amostras de leite de tanques resfriadores, mostrou eficiência diagnóstica semelhante (p McNemar > 0,05) e concordância entre os testes, kappa de 0,81 a 1,00, para S. aureus, S. agalactiae e E. coli (p > 0,0001), kappa de 0,61 a 0,80 L. monocytogenes (p > 0,0001), kappa de 0,21 a 0,40 para B. abortus (p > 0,0001) e insignificante (kappa 0,00 a 0,20) para Salmonella spp., mostrando eficiência, rapidez e baixo custo do método proposto. A elevada ocorrência de S. aureus (86,3%) e S. agalactiae (39,2%) observada em leite de tanques (n = 102), pode ser o principal obstáculo para a não obtenção dos limites legais de qualidade do leite em muitas propriedades catarinenses. A identificação de L. monocytogenes em 11,8% das unidades de produção, alerta para o risco na saúde pública de uma enfermidade negligenciada. No levantamento epidemiológico de patógenos em vacas lactantes (n = 1077), realizado por metodologia de referência, S. aureus foi identificado como principal agente infeccioso com potencial zoonótico em circulação, enquanto que em 0,46% das vacas foram detectados anticorpos anti-brucelas lisas. Em conjunto, nossos resultados mostram que o método desenvolvido poderá ser uma importante ferramenta na detecção de infecções com potencial zoonótico em bovinos leiteiros e contribuir para a implementação de estratégias racionais de vigilância e controle de patógenos de interesse no agronegócio do leite e na saúde pública.<br>

Abstract : Milk stands out as an important agribusiness product for Santa Catarina and Brazil due to its economic and social importance. Market globalization promotes investments in productivity and composition quality. However there is lack of biosecurity scrutiny for milk as food. In the dairy chain routine there is no methodology available for rapid screening and identification of pathogens of public health importance, as traditional methods are laborious, time consuming and have low efficiency. Moreover, epidemiological data on the circulation of zoonotic agents in dairy cows, as well as information on the occurrence of milk-borne disease are scarce. In this context, we have developed and evaluated a multiplex PCR analytical method for simultaneous detection in milk of six pathogens with zoonotic potential, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Brucella abortus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli and Salmonella spp. The method comprises a sample concentration step, culture enrichment for 8 hours/ 37ºC, followed by heat treatment for DNA extraction and amplification of species-specific genes. The analytical limit detection of the proposed method was of 100 fg of purified genomic DNA per reaction and 100 CFU.mL-1 in infected milk, except for B. abortus (104 CFU.mL-1). The comparison of the proposed method with reference tests for the diagnosis of each pathogen in cooled milk tank samples showed similar diagnostic efficiency (p McNemar > 0.05) and concordance between tests, kappa 0.81 to 1.00, S. aureus, S. agalactiae and E. coli (p < 0.0001), kappa 0.61 to 0.80 for L. monocytogenes (p > 0.0001), kappa 0.21 to 0.40 for B. abortus (p > 0.0001) and a nonsignificant (kappa 0.00 - 0.20) for Salmonella spp., showing efficiency, speed and low cost of the proposed method. The high incidence of S. aureus (86.3%) and S. agalactiae (39.2%) in milk tanks (n = 102), may be the main obstacle for not obtaining the legal limits milk quality in many farms in Santa Catarina. The identification of L. monocytogenes in 11.8% of the farms alerts for the public health risk of a neglected disease. In epidemiological survey of pathogens in dairy cows (n = 1077), by reference methodology assays, S. aureus was identified as the main infectious agent with zoonotic potential whereas 0.46% of cows were detected anti-smooth Brucella antibodies. Taken together, our results reveal that the proposed mPCR may be an important tool for detection of zoonotic pathogens infections in dairy cattle and contribute to the implementation of rational strategies for monitoring and control of pathogens of interest in the milk agribusiness and public health.