Engenharia genômica aplicada à detecção precoce e ao monitoramento das mudanças fisiológicas da clostridium acetobutylicum ATCC 824

Abstract

A fermentação ABE (acetona-butanol-etanol) da Clostridium acetobutyli-cum ATCC 824, muito usada industrialmente até 1940, é um dos mais importantes bioprocessos industriais. Recentemente, o interesse nesse processo foi retomado devido à necessidade de substituir fontes combus-tíveis fósseis por vetores energéticos renováveis, principalmente biohi-drogênio e biobutanol. O objetivo desta tese é contribuir para uma melhor compreensão dos problemas associados com a detecção precoce e moni-toramento das mudanças fisiológicas da C. acetobutylicum ATCC 824 em fermentações tipo batelada. Pretende-se também refinar o entendimento desse comportamento variável utilizando a informação genômica dispo-nível desta bactéria e assim contribuir para mostrar como algumas ferra-mentas da Engenharia Genômica podem incorporar novas informações aos métodos tradicionais de monitoramento de bioprocessos. É proposta a incorporação em três diferentes níveis, a saber: (i) nível genômico, (ii) nível metabólico e (iii) nível fenotípico. No nível genômico, a presente pesquisa detectou que existem seis regiões de alta similaridade, nas quais foram identificados 15 genes já mapeados. O gene rpoB foi identificado como um forte candidato a marcador molecular de variabilidade fenotípi-ca. Foi proposta uma relação entre a regulação da transcrição do gene rpoB e o pH do meio de cultura. No nível metabólico, dois modelos meta-bólicos foram desenvolvidos, um modelo simplificado de 20 reações e um modelo genômico completo de 502 reações. Foi detectado que o modelo simplificado era mais adequado para detectar as mudanças fenotípicas da bactéria. Foi criado um modelo simplificado protonado que integra infor-mações do pH do meio de cultura. No nível fenotípico, a técnica de colora-ção de Gram mostrou-se eficiente na detecção precoce das mudanças fisiológicas da C. acetobutylicum. Foi demonstrada uma correlação entre os dados de fermentação e mudanças fisiológicas da parede celular da bactéria. Sugere-se, portanto, um novo método de detecção precoce e monitoramento do estado fisiológico da C. acetobutylicum ATCC 824 (e outras espécies de Clostridium) utilizando técnicas de coloração de Gram para determinar o estado fisiológico no qual a bactéria se encontra, e quais os principais produtos metabólicos da sua fermentação.<br>

Abstract : The problem of renewable and sustainable energy is challenging and requires innovative approaches. The production of biohydrogen, and biofuels in general, particularly biobutanol in the so-called ABE fermenta-tion by Clostridium acetobutylicum, discovered in 1861 by Louis Pasteur, although extensively studied, still lacks some fundamental understanding to facilitate monitoring changes in the physiological state and optimiza-tion. Here we propose a genomic engineering approach, divided in three levels: i) genomic, ii) metabolic, iii) phenotypic. At the genomic level, a comparative whole-genome study was performed comparing C. acetobu-tylicum with six other chosen microorganisms and a in silico Gram type experiment; The whole-genome analysis detected one major gene, the rpoB gene, implied in acquired antibiotic resistance, and possibly impli-cated in phenotypic variation during ABE fermentation. A possible link between the pH regulation and rpoB expression is suggested. The 16S rRNA analysis consistently showed Gram-positive classification for the C. acetobutylicum strain used, incapable of detecting the existent phenotypic variations.at the metabolic level, two metabolic network models were developed: a simplified, core model, with 20 reactions, and a genome-wide model, comprising 502 reactions; to translate the molecular and biochemical information to a useful engineering level, a phenotypic rela-tion between the Gram stain response and pH developed during batch fermentation was analyzed. The simplified core metabolic network suc-cessfully captured the observed strain metabolic profile. Additional regu-latory mechanism was added to the simplified metabolic model with the integration of pH regulation. Using the Gram staining method, we demon-strated a strong correlation between bacterial growth and morphological changes of the cell wall that is useful in monitoring early detection of the metabolic stages of C. acetobutylicum ABE fermentation. The Gram stain-ing technique is proposed as an efficient, low cost method to identify the physiological state of the bacteria culture and its connection with the fermentation state.