Fermentação de maltotriose por leveduras Saccharomyces cerevisiae recombinantes

Abstract

Na levedura S. cerevisiae os carboidratos sacarose, maltose e maltotriose são fermentados por vias metabólicas diferentes: a sacarose é hidrolisada pela invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), enquanto maltose e maltotriose são ativamente transportadas para dentro da célula e hidrolisadas pelas a-glicosidases presentes no citoplasma (ambas proteínas codificadas pelos genes MAL). Os genes SUC também permitem a síntese de uma forma intracelular da invertase, uma enzima com nenhuma função óbvia em leveduras. No entanto, a sacarose pode também ser metabolizada por células de levedura através dos transportadores e a-glicosidases codificados pelos genes MAL. Nossos resultados mostram que a maltotriose pode ser também eficientemente fermentada pelas células de S. cerevisiae através de seu transporte ativo mediado pela permease AGT1, um transportador MAL necessário para utilização de maltotriose, e sua hidrólise intracelular mediada pela invertase intracelular. A cepa brasileira industrial utilizada na produção de etanol combustível CAT-1 não pode fermentar maltotriose eficientemente devido ao promotor do AGT1 ser defeituoso. Para aumentar a fermentação de maltotriose por esta levedura, colocamos um promotor constitutivo (PGPD) à frente do gene AGT1 presente na cepa CAT-1, gerando a linhagem GMY05. No entanto, esta linhagem não foi capaz de fermentar eficientemente a maltotriose. Por outro lado, quando esta linhagem foi modificada para sobre-expressar a forma intracelular da invertase, por substituição da sequência sinal do gene SUC2 com o promotor constitutivo PADH1, a cepa iSUC2 obtida (GMY08) fermentou maltotriose eficientemente. Utilizando condições em que os genes MAL não são expressos, foi possível mostrar que a forma intracelular da invertase é capaz de hidrolisar a maltotriose (mas não maltose ou p-nitrofenil-a-glicosídico). Assim, os nossos resultados indicam uma sobreposição inesperada no metabolismo de sacarose e maltotriose por células de levedura, indicando que a invertase intracelular pode hidrolisar da maltotriose, e oferece novas abordagens a ser aplicadas para otimizar várias fermentações industriais que utilizam hidrolisados de amido, incluindo a panificação, produção de bebidas destiladas e cerveja, ou inclusive bioetanol.<br>

Abstract : It is well known that in the yeast S. cerevisiae the sugars sucrose, maltose and maltotriose are metabolized by different pathways: sucrose is hydrolyzed by the extracellular invertase (encoded by SUC genes), while maltose and maltotriose are actively transported into the cell and hydrolyzed by intracellular a-glucosidases (both proteins encoded by MAL genes). Furthermore, the SUC genes also allow the synthesis of an intracellular form of invertase, an enzyme with no obvious function in yeasts. We have already shown that sucrose can be metabolized by yeast cells through MAL-encoded transporters and a glucosidases. Now, our results will show that maltotriose can be efficiently fermented by S. cerevisiae cells through its active transport mediated by the AGT1 permease, a MAL transporter required for maltotriose utilization, and its intracellular hydrolysis mediated by the cytoplasmic invertase. The Brazilian industrial fuel-ethanol strain CAT-1 cannot ferment maltotriose efficiently due to a defective promoter of the AGT1 gene. To increase maltotriose fermentation by this strain, we placed a strong promoter (PGPD) in the AGT1 gene of strain CAT-1, generating strain GMY05. While the AGT1 gene was indeed over-expressed in this strain (measured by real-time PCR), maltotriose was still not fermented efficiently. However, when we over-expressed the intracellular form of invertase, by replacing the signal sequence of the SUC2 gene with the strong PPGK promoter, the resulting iSUC2 strain GMY08 fermented maltotriose efficiently. Using conditions were the MAL-encoded a glucosidases could not be expressed, we showed that the intracellular form of invertase could hydrolyze maltotriose (but not maltose or p-nitrophenyl-a-glucoside). Thus, our results indicate an unexpected overlap in sucrose-maltotriose metabolism by yeast cells, showing that the intracellular invertase allows efficient maltotriose hydrolysis, and offers new approaches that can be applied to optimize several industrial fermentation processes that use starch hydrolysates, including production of bread, distilled beverages and beer, or even bioethanol.