Síntese de nanopartículas magnéticas de Poli(ureia-uretano) e aplicação como suporte na imobilização da lipase B de Candida antarctica

Abstract

Materiais superparamagnéticos encapsulados em matriz polimérica são interessantes em diversos tipos de aplicações, incluindo áreas biomédicas, processos de separação, biotecnologia e imobilização de enzimas. Neste trabalho, nanopartículas superparamagnéticas de poli(ureia-uretano), PUU, foram obtidas via polimerização interfacial em miniemulsão e utilizadas como suporte na imobilização da lipase B de Candida antarctica. Nanopartículas de magnetita com comportamento superparamagnético foram obtidas pelo método de co-precipitação e, após a síntese, as nanopartículas magnéticas, NPMs, foram recobertas com ácido oleico, AO, para a obtenção de uma superfície hidrofóbica. A síntese de nanopartículas de PUU foi conduzida utilizando 1,6-hexanodiol como poliol e diisocinato de isoforona, IPDI, como diisocianato. As NPMs-AO foram incorporadas em PUU durante a polimerização interfacial em miniemulsão. Nanopartículas de PUU com NPMs-AO incorporadas foram caracterizadas por Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier, (FTIR), análise termogravimétrica, (TGA), magnetometria de amostra vibrante, (MAV), microscopia eletrônica de transmissão, (MET), e microscopia eletrônica de varredura, (MEV-FEG). Os resultados mostraram alta eficiência de encapsulação e as análises de MAV confirmaram que NPMs-AO apresentam comportamento superparamagnético após a encapsulação. Lipase B de Candida antarctica foi imobilizada nas nanopartículas poliméricas magnéticas de PUU, (NPMs PUU), em uma única etapa durante a polimerização interfacial em miniemulsão e o derivado atraído por um campo magnético externo foi utilizado como catalisador em reações de síntese de etil oleato, geranil oleato e geranil propionato. O teor de ácidos graxos livres nas amostras, medido pelo método de titulação, mostrou que conversões em ésteres acima de 85% foram obtidas para todos os sistemas estudados. A análise de microscopia óptica de fluorescência mostrou a presença de lipase na superfície das NPMs-PUU, confirmando a formação de ligação entre enzima-suporte. Em um segundo método de imobilização, lipase B de Candida antarctica foi imobilizada em NPMs PUU em duas etapas após a polimerização interfacial em miniemulsão, com as partículas liofilizadas. O processo foi realizado pelo contato da enzima com o suporte em tampão fosfato pH 7,6, a solução foi incubada em shaker a 30 °C a 150 rpm e a atividade de esterificação enzimática foi medida. Atividades relativas acima de 85% em relação à enzima livre foram obtidas em uma hora deimobilização com concentração de enzima de 0,55 mg/mL. Análises de FTIR, MEV-FEG, estabilidade térmica (40, 60 e 80 °C), estabilidade ao pH (4, 7 e 10) e estabilidade ao armazenamento mostraram a eficiência de imobilização da lipase por adsorção em NPMs PUU, que apresentou estabilidade em diferentes condições reacionais.<br>

Abstract : Superparamagnetic materials encapsulated in a polymeric matrix are interesting for several applications, including biomedical, separation process, biotechnology and enzyme immobilization. In this work, superparamagnetic poly(urea-urethane), PUU, nanoparticles were obtained by interfacial miniemulsion polymerization and used as a support for the immobilization of lipase B from Candida antarctica (CALB). Magnetite nanoparticles presenting superparamagnetic behavior were obtained by the co-precipitation method and after the synthesis the magnetic nanoparticles, MNPs, were coated with oleic acid, OA, to provide a hydrophobic surface. The synthesis of PUU nanoparticles was performed using 1,6-hexanediol as polyol and isophorone diisocyanate, IPDI, as diisocyanate. The MNPs-OA were incorporated during the interfacial miniemulsion polymerization. PUU with MNPs-OA were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, (FTIR), thermogravimetric analysis, (TGA), electromagnetic vibrating sample magnetometry, (VSM), transmission electron microscopy, (TEM), and scanning electron microscopy, (SEM-FEG). Results showed a high encapsulation efficiency and VSM analysis showed that PUU with MNPs-OA still presented superparamagnetic behavior after the encapsulation step. CALB was immobilized on magnetic poly(urea-urethane) nanoparticles, (MNPs PUU) in a single step during the interfacial miniemulsion polymerization. After the immobilization process, the immobilized enzyme was attracted by an external magnetic field and was used as a catalyst in the synthesis of ethyl oleate, geranyl propionate and geranyl oleate. Ester conversions above 85% were obtained for all systems based on the free fatty acids contents measured by titration. Fluorescence microscopy images confirmed the immobilization of enzyme onto MNPs-PUU. CALB was immobilized on MNPs PUU in two steps after the interfacial polymerization in miniemulsion. Lipase was added to lyophilized particles (MNPs PUU) in phosphate buffer (0.1 M, pH 7.6). The mixture was incubated at 30 °C in a shaker for 30-360 min to determine the time required for maximum immobilization efficiency and the enzyme activity was determined by the esterification reactions between lauric acid and propanol. The relative activities of the immobilized enzyme in relation to free enzyme were above 85% in one hour with 0.55 mg/mL of enzyme in solution. FTIR analysis, SEM-FEG, thermal stability (40, 60 and 80 °C), pH stability (4, 7 e 10) and storagestability showed the efficiency of the method, that allowed to maintain high stability of the immobilized enzyme under different conditions.