Análise funcional de genes associados ao transporte e ao estresse oxidativo em macrófagos humanos infectados com Leishmania braziliensis e tratados com glucantime

Abstract

As Leishmanioses afetam cerca de 15 milhões de pessoas e constiuem um importante problema de saúde pública mundial. O controle da parasitose baseia-se principalmente na quimioterapia, usando como medicamento de primeira escolha o antimonial pentavalente SbV (Glucantime®). O surgimento de resistência aos fármacos de uso clínico, a ausência de vacinas eficazes, a propagação de vetores resistentes aos inseticidas tornam o controle das Leishmanioses difícil e complexo. Para entender melhor o papel dos macrófagos na Leishmaniose humana e estabelecer estratégias para prevenir os efeitos nocivos da Leishmania, dados sobre os padrões de expressão de genes e proteínas, em Macrófagos Derivados de Monócitos de Humanos (MDM) infectados com Leishmania sob condições de tratamento, são essenciais. Neste estudo, foram analisadas as alterações nos níveis de expressão de genes e proteínas de macrófagos humanos, durante a infecção in vitro por Leishmania braziliensis e tratamento com Glucantime usando qPCR-arrays, ensaios de Western blot, microscopia confocal e ensaios de inibição usando siRNA. Os resultados indicam que a infecção com L. braziliensis e o tratamento SbV conjuntamente, modulam a expressão de genes em macrófagos, em particular aqueles envolvidos na via de biossíntese da glutationa. Análises de correlação permitiram determinar superexpressão dos marcadores GSTP1, GCLM, GSR, GSS, TRX e ABCB5 tanto nos níveis do mRNA quanto das proteínas, em MDM de humanos infectados e tratados quando comparados ao grupo controle. O estudo da localização subcelular mostrou que o transportador ABCB5 apresenta uma localização predominantemente fagolisossomal, indicando que essa proteína poderia estar envolvida no transporte de Glucantime. Nos ensaios de inibição selectiva o silenciamento dos genes gstp1, gss e abcb5 aumentaram o efeito leishmanicida in vitro do SbV induzindo uma redução da sobrevivência intracelular de L. brazilienisis em macrófagos THP-1. Essa resposta foi igualmente confirmada para o gene gstp1 onde os resultados de tempo e concentração dependente mostraram que a redução da sobrevivência intracelular era observada 24h após exposição ao SbV e a uma dose menor. Nossos resultados sugerem que há uma ativação de genes envolvidos na defesa antioxidante em macrófagos humanos como resposta a infecção com L. braziliensis e o tratamento com Glucantime, potencializando a detoxificação do fármaco. Conclui-se que as proteínas GSTP1, GSS e ABCB5 seriam potenciais alvos candidatos para intervenção terapêutica mediante a inibição seletiva destes marcadores. <br>

Abstract: Leishmaniasis affects millions of people worldwide and represents a major public health problem. Leishmaniasis control relies primarily on chemotherapy, with the mainstay being pentavalent antimony (SbV) complexed to carbohydrates in the form of sodium stibogluconate (Pentostam®) or meglumine antimoniate (Glucantime®). Due to the emergence of drug resistance, the absence of effective vaccines and the spread of insecticide-resistant vectors, Leishmaniasis control is becoming extremely difficult and complex. To better understand the role of macrophages in human Leishmaniasis and to advance in new strategies to prevent the harmful effects of Leishmania parasites, information about the protein expression patterns in the context of Leishmania-infected human monocyte-derived macrophages (MDM) under drug treatment conditions are essential. In this study, we analyzed the changes in the expression levels of human MDM proteins during in vitro infection by Leishmania braziliensis and treatment with Glucantime using qPCR arrays, Western blot, confocal microscopy and siRNA inhibition assays. The results indicate that L. braziliensis infection/SbV treatment modulated the host gene expression, particularly in the glutathione biosynthesis pathway. Comparing results from gene transcription and protein expression analysis, allowed to determine that GSTP1, GCLM, GSR, GSS, TXN, and ABCB5 were strongly up-regulated at both mRNA and protein levels when compared to the control group. Subcellular localization studies showed mostly fagolissosomal location of the ABCB5 transportes, indicating that this protein may be involved in the transport of Glucantime. Selective inhibition assays by gene silencing siRNA assays of gstp1, gss and abcb5 showed an increased in vitro leishmanicidal effect to Sb exposure inducing a decrease in intracellular survival of L. brazilienisis in THP-1 macrophages. This response was also confirmed for gstp1 gene in which the results showed a time and dose-dependent effect in the reduction of intracellular survival where even at 24 hours of exposure to SbV and a lower dose of 8 mg/mL significant intracellular leishmanicidal effects were found. These analyses suggest that, modulations of human MDM by L. braziliensis infection and Glucantime treatment raise the activation of genes participating in antioxidant defense enhancing the drug detoxification. Therefore we concluded that GSTP1, GSS and ABCB5 proteins could be potential targets for therapeutic interventions by selective inhibition of these markers.