Influência dos transportadores de açucares na fermentação de xilose por linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

A biomassa lignocelulósica é uma atrativa matéria prima para a produção de bioetanol, visto que este é um resíduo abundante, renovável e que não compete com a produção de alimento. Saccharomyces cerevisiae, entretanto, não é capaz de fermentar o principal açúcar presente nesta biomassa, a xilose. Para solucionar este problema é necessária a inserção da via para metabolismo de xilose nesta levedura, mas o transporte deste açúcar, todavia persiste como um dos passos limitantes para a sua eficiente fermentação. A levedura Spathaspora arborariae, por outro lado, é naturalmente capaz de fermentar xilose com alta capacidade. Neste trabalho analisamos diversas sequências no genoma de S. arborariae, relacionadas ao transporte e metabolismo de xilose. Paralelamente, estudamos o papel dos transportadores de hexose codificados pelos genes HXT no transporte de xilose em linhagens de S. cerevisiae deletadas para um dos genes HXT1-HXT5 (linhagens hxt-knockout) ou para todos os genes HXT1-HXT7 e GAL2 (linhagem hxt-null). Avaliamos também o impacto da hidrólise extracelular de sacarose na co-fermentação de xilose em duas linhagens industriais recombinantes de S. cerevisiae. Os resultados indicaram que S. arborariae possui pelo menos dez sequências que codificam para possíveis transportadores de açúcar, embora possua apenas uma cópia dos genes para o metabolismo de xilose e via das pentose-fosfato. Com relação aos transportadores codificados pelos genes HXT, constatamos que somente através da sobre-expressão destes genes foi possível observar melhorias no desempenho fermentativo das linhagens hxt-knock ou hxt-null. Quando sobre-expresso na linhagem hxt-null, o transportador codificado pelo gene HXT1 permitiu o máximo consumo de açúcar e produção de etanol, mas foi incapaz de permitir o consumo de somente xilose. O gene HXT7 possibilitou a eficiente fermentação de xilose, mas em co-fermentações de glicose e xilose mostrou uma clara preferência por glicose. O gene HXT5 não possibilitou a utilização de xilose, enquanto que HXT2 codificou para o transportador que permitiu o consumo e fermentação de xilose com a mesma velocidade que glicose, mesmo em co-fermentações de glicose e xilose, embora tenha apresentado fermentações incompletas com consumo de apenas 58% da xilose. Com relação às linhagens industriais, foi observado que ambas as linhagens industriais consumiram xilose mais rapidamente nas co-fermentações, embora este consumo tenha sido mais eficiente em co-fermentações de sacarose com xilose. Foi observado ainda uma produção de etanol 23% superior para a linhagem que não hidrolisa sacarose extracelularmente nas co-fermentações de sacarose e xilose. Concluindo, os transportadores de açúcar de S. arborariae encontrados no genoma apresentam grande potencial para a expressão heteróloga em S. cerevisiae, e a sobre-expressão dos genes HXT1, HXT2 ou HXT7 endógenos de S. cerevisiae, aliado ao emprego de linhagens que hidrolizem a sacarose preferencialmente de maneira intracelular, permitirão a produção de etanol integrando as tecnologias de primeira e segunda geração no Brasil.<br>

Abstract : The lignocellulosic biomass is an attractive feedstock for bioethanol production, since this is an abundant and renewable waste that does not compete with food production. Saccharomyces cerevisiae, however, is not able to ferment the main sugar present in this biomass, the xylose. To solve this problem the insertion of the pathway for xylose metabolism is required in this yeast, the transport of sugar, however, remains as one of the limiting steps for the efficient xylose fermentation. The yeast Spathaspora arborariae, on the other hand, is naturally capable of fermenting xylose with high capacity. In this work we analyzed several sequences in the genome of S. arborariae related to the transport and metabolism of xylose . Parallel to this, we have studied the role of hexose transporters encoded by the HXT genes for the transport of xylose in S. cerevisiae strains deleted for the HXT1-5 genes (hxt-knockout strains) or all HXT1-7 and GAL2 genes (hxt-null strain). We also investigated the impact of extracellular hydrolysis of sucrose in fermentation and co-fermentation of xylose using two recombinant industrial strains of S. cerevisiae. Our results indicate that S. arborariae has at least ten sequences encoding for sugar transporters, although has only one copy of the genes for the metabolism of xylose and pentose phosphate pathway. Regarding the transporters encoded by the HXT genes, we saw that only by the overexpression of these genes it was observed improvements in the fermentation performance of the hxt-knockout or hxt-null strains. When overexpressed in the hxt-null strain, the transporter encoded by the HXT1gene achieved the higher sugar consumption and ethanol production, but was unable to grow on xylose only, HXT7, however, enabled the efficient fermentation of xylose, but in co-fermentation of glucose and xylose showed a clear preference for glucose. HXT5 was not able to consume xylose, while the transporter encoded by HXT2 gene allowed the consumption of xylose at the same rate as glucose, even in glucose and xylose co-fermentation, albeit exhibited truncated fermentation with less than 58% of the xylose consumption. Regarding the industrial strains, we observed a 23% higher ethanol production from the strain that does not hydrolyze sucrose extracellularly in sucrose and xylose co-fermentation assays. We also observed that both industrial strains consumed xylose faster in co- fermentations, although this consumption has been more efficient in sucrose co-fermentation rather than in glucose. In conclusion, the S. arborariae sugar transporters found here have great potential for heterologous expression in S. cerevisiae, furthermore the overexpression of the endogenous HXT1, HXT2 or HXT7 genes from S. cerevisiae and strategies employing strains that preferentially hydrolyze sucrose intracellularly will contribute in a scenario for ethanol production using technologies from the first and second generation in Brazil.