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Abstract:
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O vírus da mionecrose infecciosa de camarões (IMNV) é um patógeno que determina elevadas perdas econômicas nas fazendas de cultivo no Brasil. Os principais sinais da enfermidade são necrose e opacidade dos músculos, além de letargia dos camarões infectados. O agente etiológico da enfermidade, o IMNV, é um vírus icosaédrico e não-envelopado, sendo a proteína estrutural que constitui o capsídeo viral tem aproximadamente 100 kDa e o genoma é constituído por RNA dupla fita que possui 7.560 pb. Métodos moleculares e histológicos de diagnóstico já foram estabelecidos, porém testes rápidos de diagnóstico como testes imunocromatográficos, que possam ser utilizados em campo, ainda não estão disponíveis. O presente trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão heteróloga de um fragmento da proteína estrutural do IMNV e sua posterior utilização para a produção de anticorpos monoclonais. O RNA total do músculo esquelético de camarões Litopenaeus vanammei naturalmente infectados foi obtido e o cDNA foi produzido através de RTPCR, sendo posteriormente amplificado por PCR. Iniciadores específicos foram capazes de amplificar, através de PCR, um segmento de cDNA de 600 pb, correspondente a um fragmento da proteína estrutural do capsídeo do IMNV. O fragmento obtido foi clonado, seqüenciado e, posteriormente, sub-clonado no vetor de expressão pET-14b. Este plasmídeo de expressão foi utilizado para tranformação de bactérias E. coli BL21(DE3), com as quais foram realizados testes de expressão que possibilitaram a obtenção de uma banda protéica de 25 kDa. A confirmação da identidade da proteína heteróloga expressa foi verificada por SDS-PAGE e Western-blot. Após a purificação da proteína recombinante, esta foi utilizada na imunização de camundongos Balb/c, cujos esplenócitos foram utilizados na fusão com células de mieloma, para produção de hibridomas. A triagem dos hibridomas foi realizada através de ELISA indireto. Foram obtidos seis linhagens monoclonais produtoras de anticorpos anti-IMNV, sendo quatro anticorpos IgM (11D, 33G, 39G e 54H) e dois anticorpos IgG1 (13H, 46C). A reatividade dos anticorpos monoclonais contra extratos de tecido muscular de camarões infectados por IMNV foi avaliada através de Western blot, confirmando assim a especificidade dos anticorpos contra a proteína estrutural do IMNV. Estes anticorpos poderão ser utilizados futuramente para a produção de um kit de diagnóstico imunocromatográfico, que será útil para testes em campo, por ser uma estratégia rápida, específica e factível de ser utilizado em fazendas de cultivo de camarões. |
