Essential oil-based nanobiofungicides for the control of anthracnose and Fusarium wilt in bean plants

Abstract

O feijoeiro é bastante suscetível a doenças fúngicas, com destaque para a antracnose e murcha de Fusarium, causadas por Colletotrichum lindemuthianum e Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop), respectivamente. Esses patógenos provocam perdas econômicas significativas, e seu controle tradicional depende de fungicidas sintéticos, os quais representam riscos à saúde humana e ao meio ambiente. Como alternativa sustentável, os óleos essenciais (OEs) vêm sendo estudados por sua atividade antifúngica, embora sua baixa solubilidade em água e instabilidade física limitem sua aplicação agrícola. Para superar essas limitações, este estudo investigou a produção, estabilidade e atividade antifúngica de nanobiofungicidas à base de OEs de canela (Cinnamomum cassia, CEO), eucalipto (Eucalyptus staigeriana, EEO), palmarosa (Cymbopogon martinii, CMEO) e pimenta-da-montanha (Litsea cubeba, LEO) em três sistemas: (1) nanoemulsões O/A (OE-NEs) produzidas por emulsificação de alta energia; (2) nanopartículas de zeína carregadas com OE obtidas por nanoprecipitação assistida por ultrassom (Z-OEC, Z-OECM, Z-OEE, Z-OEL); e (3) nanopartículas de zeína carregadas com OE de C. cassia (Z-OECBE), produzidas por nanoprecipitação de baixa energia. As OE-NEs permaneceram estáveis à temperatura ambiente por 90 dias, mantendo um diâmetro hidrodinâmico (d) abaixo de 200 nm e polidispersão (PDI) < 0,3, sem separação de fases. Testes in vitro demonstraram a potência antifúngica dos OE-NEs, que inibiram completamente o crescimento micelial e a germinação de esporos de C. lindemuthianum. As Z-OEs obtidas por nanoprecipitação assistida por ultrassom apresentaram morfologia esférica, tamanho inferior a 250 nm e PDI < 0,3, indicando uma dispersão coloidal homogênea. A eficiência de encapsulação foi superior a 70 %, com interações entre o OE e a zeína evidenciadas no espectro FT-IR. As curvas TGA sugerem melhora da estabilidade térmica do OE encapsulado frente ao OE puro e de nanopartículas de zeína vazias (Z-NPs) frente a zeína pura. Z-OEs foram eficazes no controle de C. lindemuthianum, com destaque para Z-OEC e Z-OECM que inibiram 100 % do crescimento micelial e reduziram significativamente a severidade da antracnose em ensaios in vivo. A redução na severidade da doença pode estar relacionada à formação de uma película protetora na superfície foliar. As avaliações de biossegurança confirmaram que os tratamentos com Z-OEC e Z-OECM não afetaram os níveis de pigmentos fotossintéticos em plantas de feijão em comparação com os controles tratados com água. Além disso, em concentrações ambientalmente relevantes, Z-OEC não foi tóxica para peixes-zebra adultos, com taxas de sobrevivência inalteradas. Por fim, as nanopartículas Z-OECBE obtidas por nanoprecipitação de baixa energia apresentaram d entre 92 a 208 nm, com a maioria das formulações exibindo PDI < 0,25. A formulação mais promissora demonstrou estabilidade de armazenamento, mantendo d < 150 nm e PDI < 0,15 ao longo de 90 dias. Z-OECBE exibiram uma morfologia esférica e as análises TGA mostraram maior estabilidade térmica das nanopartículas de zeína em comparação com a zeína pura, bem como melhor estabilidade térmica do OEC encapsulado. Ensaios antifúngicos in vitro demonstraram que Z-OECBE foi eficaz no controle de Fop, inibindo em 70 % o crescimento micelial e em 100% a formação de colônias. Portanto, os resultados demonstram a versatilidade dos métodos de preparo e o elevado potencial dos OEs encapsulados como nanobiofungicidas. Destaca-se, ainda, a viabilidade técnica do método de baixa energia e sua possível escalabilidade, reforçando a aplicabilidade desses sistemas como estratégia viável e sustentável para o manejo de doenças em plantas.

Abstract: Common bean is highly susceptible to fungal diseases, particularly anthracnose and Fusarium wilt, caused by Colletotrichum lindemuthianum and Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop), respectively. These pathogens cause significant economic losses, and their traditional control relies on synthetic fungicides, which pose risks to both human health and the environment. As a sustainable alternative, essential oils (EOs) have been investigated for their antifungal activity; however, their low water solubility and physical instability limit agricultural applications. To overcome these challenges, this study evaluated the production, stability, and antifungal activity of EO-based nanobiofungicides formulated with cinnamon (Cinnamomum cassia, CEO), eucalyptus (Eucalyptus staigeriana, EEO), palmarosa (Cymbopogon martini, CMEO), and mountain pepper (Litsea cubeba, LEO) in three systems: (1) oil-in-water nanoemulsions (EOs-NE) prepared by high-energy emulsification; (2) zein nanoparticles loaded with EOs obtained by ultrasound-assisted nanoprecipitation (Z-CEO, Z-CMEO, Z-EEO, Z-LEO); and (3) zein nanoparticles loaded with C. cassia EO (Z-CEOLE), produced by low energy nanoprecipitation. EOs-NE remained stable for 90 days at room temperature, maintaining a hydrodynamic diameter (d) below 200 nm, polydispersity (PDI) < 0.3, and no phase separation. In vitro assays confirmed their strong antifungal activity, with complete inhibition of both mycelial growth and spore germination of C. lindemuthianum. Ultrasound assisted Z-EOs exhibited spherical morphology, particle sizes below 250 nm, PDI < 0.3, and encapsulation efficiencies above 70 %. FT-IR confirmed EOâ zein interactions, while TGA analyses indicated improved thermal stability compared with free EOs and empty zein nanoparticles (Z-NPs). Among the formulations, Z-CEO and Z-CMEO completely inhibited mycelial growth of C. lindemuthianum and significantly reduced anthracnose severity in vivo, likely due to the formation of a protective film on leaf surfaces. Biosafety assessments confirmed that treatments with Z-CEO and Z-CMEO did not affect photosynthetic pigment levels in bean plants compared to water-treated controls. Furthermore, at environmentally relevant concentrations, Z-CEO was not toxic to adult zebrafish, with survival rates remaining unchanged. Z-CEOLE prepared by low-energy nanoprecipitation ranged from 92 to 208 nm in size, with most formulations showing PDI < 0.25. The most promising formulation remained stable for 90 days, maintaining sizes below 150 nm and PDI < 0.15. These nanoparticles exhibited spherical morphology and enhanced thermal stability relative to pure zein and free EO. In vitro antifungal tests demonstrated that Z-CEOLE effectively controlled Fop, reducing mycelial growth by 70 % and completely suppressing colony formation. Overall, the results highlight the versatility of the preparation methods and the strong potential of EO-based nanobiofungicides. Furthermore, the success of the low-energy nanoprecipitation method demonstrates its technical feasibility and scalability, positioning these systems as a sustainable and viable strategy for managing plant diseases.