A importância da membrana peritrófica na organização da digestão nas larvas dos carunchos pragas de feijão Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus

Abstract

A organização da digestão em insetos-praga de feijão, como os carunchos (bruquíneos) Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, permanece incompletamente compreendida, especialmente quanto à presença da membrana peritrófica (MP) no intestino-médio (IM). Em outros insetos, a MP está associada à organização do lúmen intestinal, compartimentalização da digestão e proteção do epitélio. Esta tese investigou a ocorrência da MP em larvas dessas espécies e sua contribuição para a compartimentalização da atividade enzimática, o transporte de água e a organização funcional do IM. Foram realizados ensaios biológicos com fluoróforos ligantes de quitina, análises histoquímicas, microscopia de luz e eletrônica de transmissão e de varredura, ensaios enzimáticos e análise transcriptômica. A MP foi identificada na região posterior do IM por meio de marcação com calcofluor e lectina de trigo acoplada à fluoresceína isotiocianato (WGA-FITC), além da observação de uma estrutura lamelar característica em cortes histológicos analisados por microscopia de luz. Essas evidências foram obtidas em ambas as espécies analisadas, enquanto experimentos fisiológicos e análises transcriptômicas foram conduzidos principalmente em larvas de Z. subfasciatus. Também foi evidenciada a presença de muco revestindo o epitélio ao longo de todo o IM. A análise transcriptômica revelou maior expressão de genes relacionados à síntese da MP na região posterior do IM, enquanto genes associados a mucinas apresentaram expressão ao longo de todo o órgão. Embora a a-amilase seja discretamente mais expressa na região anterior do IM, os ensaios enzimáticos demonstraram maior atividade na região média, sugerindo redistribuição das enzimas ao longo do lúmen intestinal e concentração funcional próxima ao início da MP, compatível com o modelo de reciclagem enzimática mediado por contrafluxo. A administração de furosemida alterou a distribuição espacial da atividade enzimática, indicando que transportadores de íons e água participam da manutenção dos fluxos luminais que sustentam a circulação endoectoperitrófica e, consequentemente, da reciclagem enzimática. Adicionalmente, as atividades de a-amilase medidas em larvas alimentadas com amido de batata evidenciaram o deslocamento dessas enzimas ao longo do IM, indicando maior evacuação enzimática quando saturadas pelo substrato, o que reforça a dinâmica de circulação luminal associada à reciclagem enzimática. Diferenças ultraestruturais entre regiões do IM evidenciaram áreas predominantemente secretoras e absortivas, corroborando a existência de compartimentalização funcional. Os resultados demonstram que a MP, embora restrita à porção posterior do IM, exerce papel relevante na organização espacial da digestão, contribuindo para a proteção epitelial e para a eficiência do processo digestivo. Em conjunto, os resultados indicam que a digestão nesses insetos envolve a compartimentalização em espaços endoperitrófico e ectoperitrófico e a circulação endoectoperitrófica em uma região definida do IM. Paralelamente, uma camada contínua de muco reveste todo o epitélio intestinal, inclusive nas regiões onde a MP está presente, assegurando proteção epitelial ao longo do órgão. Esses achados esclarecem a organização digestiva em bruquíneos ao demonstrar que a MP é regionalizada e funcionalmente integrada à circulação endoectoperitrófica e à reciclagem de enzimas digestivas, enquanto uma camada mucosa contínua reveste todo o IM e contribui para a proteção do epitélio intestinal. Além de ampliar o entendimento da fisiologia molecular da digestão em bruquíneos, esses resultados fornecem base para investigações sobre mecanismos de adaptação alimentar e interação inseto-semente, podendo também subsidiar estratégias de controle direcionadas a processos digestivos e componentes da barreira intestinal.

Abstract: The organization of digestion in bean weevils such as Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus remains incompletely understood, particularly regarding the occurrence of the peritrophic membrane (PM) in the midgut. In other insects, the PM is associated with luminal organization, compartmentalization of digestion, and epithelial protection. This thesis investigated the occurrence of the PM in larvae of these species and its contribution to the compartmentalization of enzymatic activity, water transport, and functional organization of the midgut. Biological assays using chitin-binding fluorophores, histochemical analyses, light microscopy, transmission and scanning electron microscopy, enzymatic assays, and transcriptomic analyses were performed. The PM was identified in the posterior region of the midgut lumen through calcofluor staining and fluorescein isothiocyanate-conjugated wheat germ agglutinin (WGA-FITC), as well as by the observation of a characteristic lamellar structure in histological sections analyzed by light microscopy. This evidence was obtained in both species, whereas physiological experiments and transcriptomic analyses were conducted mainly in Z. subfasciatus larvae. The presence of a mucus layer lining the epithelium throughout the midgut was also demonstrated. Transcriptomic analyses revealed higher expression of genes related to PM synthesis in the posterior region of the midgut, whereas genes associated with mucins were expressed throughout the organ. Although a-amylase transcripts were slightly more abundant in the anterior region of the midgut, enzymatic assays demonstrated higher activity in the middle region, suggesting redistribution of enzymes along the gut lumen and functional concentration near the beginning of the PM, consistent with the counterflow-mediated enzyme recycling model. Administration of furosemide altered the spatial distribution of enzymatic activity, indicating that ion and water transporters participate in maintaining luminal flows that support endoectoperitrophic circulation and, consequently, enzyme recycling. In addition, measurements of a-amylase activity in larvae fed potato starch showed displacement of these enzymes along the midgut lumen, indicating increased enzyme flow when saturated with substrate and reinforcing the existence of luminal circulation dynamics associated with enzyme recycling. Ultrastructural differences among midgut regions revealed predominantly secretory and absorptive areas, corroborating the existence of functional compartmentalization. The results demonstrate that the PM, although restricted to the posterior portion of the midgut, plays a relevant role in the spatial organization of digestion, contributing to epithelial protection and digestive efficiency. Taken together, the results indicate that digestion in these insects involves compartmentalization into endoperitrophic and ectoperitrophic spaces, as well as endoectoperitrophic circulation within a defined region of the midgut. Simultaneously, a continuous mucus layer lines the entire intestinal epithelium, including regions where the PM is present, ensuring epithelial protection throughout the organ. These findings elucidate digestive organization in bruchids by demonstrating that the PM is regionalized and functionally integrated with endoectoperitrophic circulation and digestive enzyme recycling, while a continuous mucus layer contributes to the protection of the intestinal epithelium throughout the midgut. In addition to broadening the understanding of digestive physiology in bruchids, these results provide a basis for future investigations into mechanisms of dietary adaptation and insect-seed interactions, and may also support the development of control strategies targeting digestive processes and components of the intestinal barrier.