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Abstract:
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Nanopartículas lipídicas (NPLs) têm se destacado como sistemas de liberação de ácidos nucleicos por favorecerem sua proteção e internalização celular. Dentre esses, o miRNA-124 (miR-124) apresenta interesse para aplicações no sistema nervoso central devido à sua participação em mecanismos associados à neuroproteção. Entretanto, a obtenção de NPLs com características reprodutíveis depende do controle das condições de preparo. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo desenvolver e otimizar o processo de preparação de NPLs contendo miR-124 por tecnologia microfluídica. As NPLs foram constituídas por DODMA/ DOTAP como lipídios catiônicos, além de DSPC, DSPE-PEG2000 e colesterol na razão molar de 50:10:1,5:38,5 e concentração total de lipídios de 12,5 mM. NPLs contendo miR-124 foram preparadas na razão N/P (lipídio catiônico/miRNA) de 10:1. A preparação foi realizada por diluição de uma fase etanólica contendo os lipídios em uma fase aquosa de tampão acetato pH 4 contendo o miRNA usando a plataforma microfluídica TAMARA® (Inside Therapeutics), seguida de diálise contra tampão fosfato pH 7,4. O efeito das condições de preparação como razão da taxa de fluxo (Flow Rate Ratio – FRR) entre fase aquosa e fase orgânica (3, 4 e 5), taxa de fluxo total (TFR - Total Flow Rate) 2000, 4000 e 6000 L/min e geometria do chip microfluídico (Herringbone ou Baffle) foi avaliado empregando planejamento experimental fatorial 2³ com quatro ensaios em pontos centrais. As NPLs foram caracterizadas quanto ao tamanho, índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta em equipamento Zetasizer Nano ZS, e quanto à eficiência de encapsulação (%EE) e teor de miR-124 pelo ensaio com RiboGreen®. Os efeitos principais e suas interações foram avaliados por regressão fatorial e ANOVA, seguidos de otimização simultânea das respostas, pelo software Minitab®. As NPLs contendo miR-124 apresentaram tamanho nanométrico adequado, entre cerca de 50 e 100 nm, PDI < 0,30 e potencial zeta próximo da neutralidade (~ -1,5 mV). Os resultados evidenciaram que nenhum dos fatores estudados afetou significativamnte o tamanho e o PDI (p > 0,05). Por outro lado, a %EE foi afetada significativamente com a alteração da FRR, reduzindo para os maiores valores testados (p = 0,025), enquanto uma tendência à redução do teor de miR-124 foi verificada para este fator. A condição otimizada selecionada, priorizando a maximização da %EE e do teor de miR-124, foi FRR de 3, TFR de 6000 µL/min e chip Herringbone, resultando em NPLs com tamanho de 64,2 ± 7,8 nm, PDI de 0,116 ± 0,045, %EE de 93,4 ± 1,98% e teor de 108,0 ± 6,3 µg/mL. Os resultados indicam que a tecnologia microfluídica associada ao planejamento experimental permite identificar efeitos individuais e interações relevantes entre parâmetros de processo, contribuindo para a seleção racional de condições de preparo e para o aprimoramento futuro da robustez e do escalonamento das NPLs contendo miR-124. |
