Avaliação do perfil senescente de células estromais mesenquimais durante o cultivo e do efeito rejuvenescedor do seu secretoma in vitro

Abstract

A necessidade de expansão in vitro para obtenção da quantidade de células estromais mesenquimais (MSCs) necessária para uso terapêutico, resulta na senescência devido à exaustão da capacidade proliferativa destas células ou devido a alterações na fisiologia celular decorrentes do ambiente in vitro. O envelhecimento tem a senescência celular e o esgotamento das células-tronco como dois importantes marcadores. Resultados benéficos da terapia com MSCs foram observados no tratamento de doenças associadas ao envelhecimento e no rejuvenescimento celular, sendo que a utilização do seu secretoma poderia ser uma alternativa ao uso direto dessas células como estratégia antienvelhecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil senescente de MSC durante o cultivo in vitro e o efeito rejuvenescedor do seu secretoma através de revisão sistematizada da literatura e experimentos in vitro. No primeiro capítulo foi realizada uma revisão sistematizada da literatura sobre o efeito do secretoma de MSC sobre o rejuvenescimento celular, no qual foi demonstrado que independentemente da forma do secretoma, espécie animal e origem tecidual, o secretoma das MSC foi capaz de resgatar células de um estado senescente, promovendo o aumentando da proliferação celular e resgatando células da parada do ciclo celular, reduzindo a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular, reduzindo danos ao DNA, aumentando a migração celular, reduzindo a coloração de ß-galactosidase e recuperando funções mitocondriais e lisossomais. Os efeitos benéficos foram observados tanto in vitro em células senescentes de diversos tipos como pele, vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, coração, fígado e pâncreas quanto in vivo em tratamento de cicatrização de feridas, úlceras cutâneas, aneurismas, degeneração do disco intervertebral, osteoartrite, tendinopatia e envelhecimento cronológico. No Capítulo II, foram analisados os perfis mesenquimal e senescente das MSCs derivadas da derme (DSCs) de dois doadores de idades cronológicas próximas ao longo do cultivo. As DSCs do doador 1 apresentam maior capacidade proliferativa, migratória e potencial de diferenciação, com perda gradual ao longo do cultivo, podendo ser mantidas até passagem 30 (P30), com um desencadeamento mais lento da senescência. Uma redução no comprimento dos telômeros entre P5 e P30 foi observada, indicando senescência replicativa. As DSC do doador 2 foram mantidas em cultivo apenas até P12, apresentando desde as passagens iniciais menor capacidade proliferativa, migratória e de diferenciação quando comparados as DSCs do doador 1. Interessantemente, apesar de apresentarem mais marcadores de senescência, como a quantidade de células positivas para ß-galactosidase e morfologia senescência já em P12, não houve diferença no comprimento dos telômeros entre P5 e P12, indicando senescência precoce induzida por estresse. Estes resultados confirmam a heterogeneidade entre os perfis mesenquimais e senescentes de DSCs de diferentes doadores. Por fim, no Capítulo III, foi analisado o efeito protetor e de reversão da citotoxicidade do meio condicionado das DSC (mcDSC) no tratamento de queratinócitos da linhagem HaCaT expostos ao H2O2. O tratamento com mcDSC (a 50% e 75%) após o insulto com H2O2 foi mais eficiente na manutenção da viabilidade das HaCaTa do que antes do insulto, sugerindo que a sua utilização na recuperação de danos é mais eficaz do que seu efeito protetor. Também foi observado um possível efeito antioxidante, contudo, mais testes são necessários para confirmar essa ação do mcDSC.

Abstract: The in vitro expansion of mesenchymal stromal cells (MSCs) to obtain the quantity necessary for therapeutic use often results in senescence due to the exhaustion of their proliferative capacity or changes in cell physiology. In aging, cellular senescence and stem cell depletion are critical markers. In addition, beneficial results from MSC therapy have been observed in the treatment of aging-associated diseases and cellular rejuvenation, suggesting that the use of these cells' secretome could be an alternative to direct use as an anti-aging strategy. Therefore, this study aimed to evaluate the senescent profile of MSCs during in vitro cultivation and the rejuvenating effect of their secretome through a systematic literature review and in vitro experiments. Initially, a quasi systematic review of the literature on the effect of the MSC secretome on cellular rejuvenation was conducted, as described in Chapter I. The results demonstrated that, regardless of the form of the secretome, animal species, and tissue origin, the MSC secretome was able to rescue cells from a senescent state. This effect included increased cell proliferation, re-entering in the cell cycle by reducing the expression of cell cycle inhibitory proteins, in addition to reduced DNA damage, enhanced cell migration, reduced ß-galactosidase staining, and recovery of mitochondrial and lysosomal functions. The beneficial effects were observed both in vitro in senescent cells of various types such as skin, blood vessels, connective tissue, heart, liver, and pancreas, and in vivo in the treatment of wound healing, aneurysms, intervertebral disc degeneration, osteoarthritis, tendinopathy, and chronological aging. In Chapter II, the mesenchymal and senescent profiles of dermal-derived MSCs (DSCs) from two donors were analyzed during cultivation. DSCs from donor 1 exhibited higher proliferative, migratory, and differentiation capacities and could be maintained up to passage 30 (P30) with a slower onset of senescence. A reduction of telomere length was observed between P5 and P30, indicating replicative senescence. In contrast, DSCs from donor 2 were maintained in culture only up to P12, showing lower proliferative, migratory, and differentiation capacities from the initial passages compared to DSCs from donor 1. Interestingly, despite exhibiting more senescence markers, such as the number of ß-galactosidase positive cells and senescent morphology as early as P12, there was no difference in telomere length between P5 and P12, indicating stress-induced premature senescence. These results confirm that DSCs from different donors display dissimilar mesenchymal and senescence profiles. Finally, in Chapter III, the protective and reversing effect of DSCs´ conditioned medium (mcDSC) on the cytotoxicity of HaCaT keratinocytes exposed to H2O2 was analyzed. The mcDSC (at both 50% and 75%) treatment after H2O2 insult was more effective in maintaining HaCaT viability than before the insult, suggesting that its use in damage recovery is more effective than its protective effect. A possible antioxidant effect was also observed; however, more tests are needed to confirm this action of mcDSC.