Avaliação do efeito anti-inflamatório e avaliação toxicológica da aril-ciclohexanona: estudos in sílico, in vitro e in vivo com foco no potencial agonismo sobre receptores canabinoides tipo 2 (CB2)

Abstract

Evidências crescentes indicam que o sistema endocanabinoide desempenha um papel imunomodulador, sustentando a hipótese de que canabinoides exógenos podem exercer efeitos imunossupressores e anti-inflamatórios. Sob esta perspectiva, a molécula denominada dietil-4-hidroxi-2-(4-metoxifenil)-4-metil-6-oxociclohexano-1,3-dicarboxilado foi sintetizada com semelhanças estruturais ao arcabouço bicíclico de fitocanabinoides já conhecidos por seu potencial anti-inflamatório. Diante disso, esta pesquisa objetivou a avaliação do potencial terapêutico do diéster de aril-ciclohexanona em estudos in sílico, in vitro e in vivo. Buscou-se elucidar o perfil imunomodulador da molécula por meio de ensaios in vitro, empregando o modelo de inflamação induzida por lipopolissacarídeo em macrófagos murinos da linhagem J774, além de avaliar seu potencial efeito agonista sobre o receptor canabinoide tipo 2 (CB2) em macrófagos humanos da linhagem THP-1 submetidos ao modelo inflamatório e paralelamente ao antagonista seletivo do receptor CB2 (SR 144528). Além disso, procedeu-se à análise in sílico da interação específica da molécula em estudo frente ao receptor CB2, bem como a estabilidade do complexo ligante-receptor por meio de estudos de acoplamento e dinâmica molecular. Quanto a avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo, utilizou-se o modelo murino de lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo, bem como na avaliação da toxicidade oral aguda seguindo a diretriz nº 423 da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico - OECD. Os resultados demonstraram que em linhagem de macrófagos murinos J774, o composto apresentou efeito anti-inflamatório e perfil imunomodulador, exibindo características de modulação fenotípica em direção a macrófagos M2. O tratamento com o composto demonstrou preservar a viabilidade celular e reduzir a produção de metabólitos de óxido nítrico em todas as concentrações avaliadas (1 a 100µM). Observou-se também a normalização de eventos apoptóticos, acompanhada de aumento do potencial fagocítico. Ademais, o composto diminuiu a expressão do receptor Toll-like 4, promovendo simultaneamente o aumento da expressão do receptor de manose (CD206). Esses efeitos foram associados a uma redução na síntese de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-12p70, TNF-a, IFN-?, MCP-1 e IL-6. Em macrófagos humanos da linhagem THP-1, a molécula manteve sua atividade anti-inflamatória apenas na ausência do antagonista seletivo CB2 (SR 144528), preservando a viabilidade celular em todas as concentrações testadas (1 a 1000µM) e reduzindo a produção de metabólitos de óxido nítrico na melhor concentração (1µM). As análises in sílico demonstraram que o composto estabelece interação específica e energeticamente favorável com o receptor CB2, mantendo estabilidade no sítio de ligação ao longo de toda a simulação de dinâmica molecular. O composto exerceu ação anti-inflamatória em modelo murino de lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo. A atividade foi evidenciada em todas as doses testadas (3, 10 e 30mg/mL) pela expressiva redução da migração leucocitária e da exsudação observadas no lavado broncoalveolar. Concomitantemente, verificou-se redução significativa da atividade da enzima mieloperoxidase, bem como das concentrações de metabólitos de óxido nítrico e de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-a, IL-6, IFN-? e MCP-1. Por fim, os estudos de toxicidade oral aguda demonstraram que a aril-ciclohexanona não apresentou sinais de toxicidade, apresentando DL50 superior a 5000mg/kg. Em conclusão, os resultados obtidos demonstram que o diéster de aril-ciclohexanona apresenta efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores significativos, decorrentes de seu agonismo sobre o receptor CB2, configurando-se como um candidato promissor para o desenvolvimento de novos fármacos direcionados ao tratamento de doenças inflamatórias complexas e refratárias às terapias convencionais.

Abstract: Growing evidence indicates that the endocannabinoid system plays an immunomodulatory role, supporting the hypothesis that exogenous cannabinoids may exert immunosuppressive and anti-inflammatory effects. From this perspective, the molecule diethyl 4-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4-methyl-6-oxocyclohexane-1,3-dicarboxylate was synthesized based on structural similarities to the bicyclic scaffold of phytocannabinoids previously recognized for their anti-inflammatory potential. Accordingly, the present study aimed to evaluate the therapeutic potential of this aryl-cyclohexanone diester through in silico, in vitro, and in vivo investigations. The study sought to elucidate the immunomodulatory profile of the molecule by means of in vitro assays employing a lipopolysaccharide-induced inflammation model in murine J774 macrophages, as well as to assess its potential agonistic effect on the cannabinoid receptor type 2 (CB2) in human THP-1 macrophages subjected to the inflammatory model in parallel with the selective CB2 receptor antagonist SR144528. Furthermore, in silico analyses were performed to investigate the specific interaction of the compound with the CB2 receptor, as well as the stability of the ligand?receptor complex through molecular docking and molecular dynamics simulations. For the in vivo evaluation of anti-inflammatory activity, a murine model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury was employed, in addition to an acute oral toxicity assessment conducted according to guideline No. 423 of the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). The results demonstrated that, in murine J774 macrophages, the compound exhibited anti-inflammatory and immunomodulatory effects, displaying phenotypic modulation toward an M2 macrophage profile. Treatment with the compound preserved cell viability and reduced nitric oxide metabolite production at all tested concentrations (1-100 µM). Normalization of apoptotic events was also observed, accompanied by enhanced phagocytic potential. Moreover, the compound reduced Toll-like receptor 4 expression while simultaneously increasing mannose receptor (CD206) expression. These effects were associated with decreased synthesis of pro-inflammatory cytokines, including IL-12p70, TNF-a, IFN-?, MCP-1, and IL-6. In human THP-1 macrophages, the molecule maintained its anti-inflammatory activity only in the absence of the selective CB2 antagonist SR144528, preserving cell viability at all tested concentrations (1-1000 µM) and reducing nitric oxide metabolite production at optimal concentration (1 µM). In silico analyses demonstrated that the compound establishes a specific and energetically favorable interaction with the CB2 receptor, maintaining stability within the binding site throughout the entire molecular dynamic?s simulation. The compound also exerted anti-inflammatory activity in the murine model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury. This activity was evidenced at all tested doses (3, 10, and 30mg/mL) by a marked reduction in leukocyte migration and exudation in bronchoalveolar lavage fluid. Concomitantly, a significant reduction in myeloperoxidase enzyme activity, nitric oxide metabolite concentrations, and pro-inflammatory cytokines, including TNF-a, IL-6, IFN-?, and MCP-1, was observed. Finally, acute oral toxicity studies demonstrated that the aryl-cyclohexanone compound did not exhibit signs of toxicity, with an LD50 greater than 5000mg/kg. In conclusion, the findings demonstrate that the aryl-cyclohexanone diester exhibits significant anti-inflammatory and immunomodulatory effects resulting from its agonistic activity on the CB2 receptor, thereby representing a promising candidate for the development of novel therapeutics targeting complex inflammatory diseases refractory to conventional therapies.