Avaliação comparativa do efeito da radiação ultravioleta B e peróxido de hidrogênio nos parâmetros de senescência de queratinócitos e fibroblastos, in vitro

Abstract

O envelhecimento cutâneo é um processo complexo influenciado por fatores intrínsecos e extrínsecos que induzem alterações morfológicas e funcionais em diferentes tipos celulares da pele. Dentre os mecanismos associados a esse processo, destaca-se a senescência celular, caracterizada pela parada irreversível do ciclo celular, acompanhada de alterações na expressão gênica, secreção de mediadores inflamatórios e reorganização estrutural. A senescência afeta os queratinócitos e fibroblastos da pele, levando à perda de elasticidade, inflamação, diminuição da espessura e redução da capacidade de regeneração, contribuindo significativamente para o processo do envelhecimento. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo comparar o efeito da Radiação Ultravioleta B (UVB) e do Peróxido de Hidrogênio (H2O2) na indução de senescência em queratinócitos (HaCaT) e fibroblastos (HDFA) da pele, avaliando diferenças na expressão de biomarcadores de senescência e na susceptibilidade celular. Para tanto, as culturas celulares foram submetidas à exposição única à radiação UVB ou ao H2O2 em diversas doses e concentrações. Através da análise morfológica e de viabilidade, a dose de 2,5 mJ/cm2 de UVB e a concentração de 50 µM de H2O2 foram escolhidas para a avaliação dos parâmetros de senescência. Foram então avaliados o dano ao DNA através do ensaio de imunocitoquímica para ?-H2AX, a atividade da ß-galactosidase associada à senescência (SA-ß-Gal), a morfologia dos núcleos com auxílio do software ImageJ e o plugin StarDist, e a expressão gênica relativa de TP53, CDKN1, SIRT2, FOXO1 e NFE2L2, através da RT-qPCR. Os resultados indicaram que ambos os indutores foram eficazes na indução da senescência em queratinócitos e fibroblastos, com diferenças importantes entre indutores e tipo celular. Entre os biomarcadores utilizados, o ?-H2AX, a área e o perímetro nuclear, a SA-ß-Gal e o gene CDKN1 apresentaram-se como os de maior interesse, com destaque para CDKN1 e SA-ß-Gal nos fibroblastos e ?-H2AX nos queratinócitos. Evidencia-se ainda a heterogeneidade populacional após a exposição aos indutores, uma vez que nenhum marcador identificou 100% das células como senescentes. Em geral, ambas as linhagens foram mais sensíveis à exposição ao H2O2, que foi capaz de alterar uma maior quantidade de biomarcadores de senescência em relação à UVB. Apesar de exibirem maior viabilidade celular frente aos estressores, os fibroblastos demonstraram um perfil senescente mais robusto, evidenciado pela alteração de múltiplos biomarcadores. Essas diferenças destacam a necessidade de modelos de senescência celulares específicos para estudos sobre o envelhecimento cutâneo e seus mecanismos, e terapias associadas.

Abstract: Cutaneous aging is a complex process influenced by both intrinsic and extrinsic factors that induce morphological and functional alterations in various skin cell types. Among the mechanisms associated with this process, cellular senescence stands out, characterized by irreversible cell cycle arrest, accompanied by changes in gene expression, secretion of inflammatory mediators, and structural reorganization. Senescence affects keratinocytes and fibroblasts in the skin, leading to loss of elasticity, inflammation, thinning of the skin, and reduced regenerative capacity, contributing significantly to the aging process. In this context, the present study aimed to compare the effect of Ultraviolet B Radiation (UVB) and Hydrogen Peroxide (H2O2) on the induction of senescence in keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDFA), evaluating differences in the expression of senescence biomarkers and cellular susceptibility. For this purpose, cell cultures were subjected to a single exposure to UVB or H2O2 at various doses and concentrations. Based on morphological and viability analyses, a dose of 2.5 mJ/cm² of UVB and a concentration of 50 µM of H2O2 were selected for further senescence assessments. DNA damage was evaluated by immunocytochemistry for ?-H2AX, senescence-associated ß-galactosidase (SA-ß-Gal) activity was assessed, nuclear morphology was analyzed using ImageJ software and the StarDist plugin, and the relative gene expression of TP53, CDKN1, SIRT2, FOXO1, and NFE2L2 was quantified by RT-qPCR. The results indicated that both inducers were effective in triggering senescence in keratinocytes and fibroblasts, with notable differences between inducers and cell types. Among the biomarkers used, ?-H2AX, nuclear area and perimeter, SA-ß-Gal, and CDKN1 gene expression emerged as the most relevant, with CDKN1 and SA-ß-Gal standing out in fibroblasts and ?-H2AX in keratinocytes. Population heterogeneity after exposure to stressors was evident, as no single marker identified 100% of the cells as senescent. Overall, both cell lines were more sensitive to H2O2 exposure, which induced alterations in a greater number of senescence biomarkers compared to UVB. Despite exhibiting higher viability under stress conditions, fibroblasts showed a more robust senescent phenotype, as evidenced by changes in multiple biomarkers. These differences underscore the need for distinct cellular senescence models for studies on skin aging, its underlying mechanisms, and related therapeutic strategies.