Prospecção de leveduras tolerantes ao geraniol e engenharia da via do mevalonato em Saccharomyces cerevisiae: desafios e potenciais biotecnológicos

Abstract

A crescente demanda por compostos de alto valor agregado obtidos de forma sustentável tem impulsionado o uso de microrganismos como plataformas biotecnológicas. Nesse contexto, os monoterpenóides, como o geraniol, destacam-se por suas aplicações nas indústrias cosmética, farmacêutica e alimentícia. Por isso, o presente trabalho buscou inicialmente a seleção de leveduras tolerantes ao geraniol, considerando a toxicidade exercida por este composto sobre as células. Assim sendo, realizamos uma triagem de leveduras indígenas através de cultivos em microescala na presença de diferentes concentrações do composto e distintas fontes de carbono. Dentre as cepas avaliadas, destacaram-se isolados pertencentes à espécie Meyerozyma caribbica e um isolado não identificado (CHAP-303), os quais apresentaram maior tolerância, especialmente em meios contendo glicose. Durante esses testes, destacou-se também a levedura industrial Saccharomyces cerevisiae PE-2, cujo background genético foi então escolhido para a próxima etapa do trabalho, que passava a visar a produção de geraniol. A partir disso, foram construídas linhagens recombinantes derivadas dessa levedura. Primeiramente, o gene CrGES, proveniente de Catharanthus roseus, foi integrado no genoma de uma linhagem derivada da PE-2 (MP-P5-Bgl1YL), dando origem à cepa MP-P5-Bgl1YL-CrGES. Na sequência, estratégias de engenharia metabólica, como a sobre-expressão e truncagem do gene HMG1, foram empregadas com o objetivo de aumentar o fluxo da via do mevalonato e, consequentemente, a produção de geraniol, originando a MP-P5-Bgl1YL-CrGES-tHMG1. Paralelamente, uma cepa laboratorial de S. cerevisiae também foi transformada, originando a linhagem CEN.PK-GES, que continha o gene CrGES sob o controle de um promotor distinto. As linhagens parentais e recombinantes foram avaliadas quanto ao crescimento celular, consumo de substratos e produção de metabólitos em cultivos em microescala e em frascos agitados. A produção de geraniol foi analisada por técnicas cromatográficas, mas as cepas de S. cerevisiae modificadas não foram capazes de sintetizar o composto alvo. No intuito de compreender o que poderia estar relacionado a essa ausência de produção, análises de expressão gênica por PCR em tempo real foram realizadas. Os dados demonstraram que a expressão relativa do gene CrGES foi menor nas cepas de S. cerevisiae aqui construídas do que na linhagem de Yarrowia lipolytica BYa3105, sabidamente produtora de geraniol. Os resultados reforçam, portanto, os desafios para fazer de S. cerevisiae uma produtora de geraniol relevante para a indústria. Nossos dados indicam que mais modificações genéticas são necessárias para permitir o direcionamento do fluxo metabólico para a produção do terpenóide nessa levedura. Por outro lado, as linhagens de S. cerevisiae engenheiradas apresentaram capacidade de consumir diferentes fontes de carbono, incluindo xilose e celobiose, o que reforça seu potencial como plataforma versátil para processos biotecnológicos baseados em substratos lignocelulósicos. Dessa forma, apesar das limitações atuais na produção de geraniol, essas leveduras possuem características metabólicas promissoras que podem ser exploradas em futuras estratégias de engenharia metabólica, visando o aproveitamento eficiente de matérias-primas renováveis e a produção sustentável de compostos de alto valor agregado.

Abstract: The growing demand for high value-added compounds produced through sustainable processes has driven the use of microorganisms as biotechnological platforms. In this context, monoterpenoids such as geraniol stand out due to their applications in the cosmetic, pharmaceutical, and food industries. Accordingly, this study initially focused on the selection of geraniol-tolerant yeasts, considering the toxicity exerted by this compound on cells. To this end, wild yeasts were screened through microscale cultivations in the presence of different concentrations of geraniol and distinct carbon sources. Among the evaluated strains, isolates belonging to the species Meyerozyma caribbica and an unidentified isolate (CHAP-303) showed the highest tolerance, particularly in glucose-containing media. During these assays, the industrial yeast Saccharomyces cerevisiae PE-2 also exhibited notable performance, and its genetic background was therefore selected for the next stage of the study, which aimed at geraniol production. Based on this, recombinant strains derived from PE-2 were constructed. First, the CrGES gene from Catharanthus roseus was integrated into the genome of a PE-2-derived strain (MP-P5-Bgl1YL), giving rise to strain MP-P5-Bgl1YLCrGES. Subsequently, metabolic engineering strategies, including overexpression and truncation of the HMG1 gene, were employed to increase flux through the mevalonate pathway and, consequently, geraniol biosynthesis, resulting in strain MP-P5-Bgl1YLCrGES-tHMG1. In parallel, a laboratory strain of S. cerevisiae was also transformed, generating strain CEN.PK-GES, in which the CrGES gene was placed under the control of a different promoter. Parental and recombinant industrial and laboratory strains were evaluated for cell growth, substrate consumption, and metabolite production in both microscale cultivations and shake-flask experiments. Geraniol production was analyzed by chromatographic techniques; however, the engineered S. cerevisiae strains were not able to synthesize the target compound. To better understand the lack of production, gene expression analyses were performed using real-time PCR. The results showed that the relative expression of CrGES in the S. cerevisiae strains constructed in this study was lower than that observed in the strain Yarrowia lipolytica BYa3105, a known geraniol producer. These findings highlight the challenges associated with developing S. cerevisiae as an efficient geraniol-producing platform for industrial applications. Our data indicate that additional genetic modifications are required to enable effective redirection of metabolic flux toward terpenoid biosynthesis in this yeast. On the other hand, the engineered S. cerevisiae strains demonstrated the ability to utilize different carbon sources, including xylose and cellobiose, reinforcing their potential as versatile platforms for biotechnological processes based on lignocellulosic substrates. Thus, despite the current limitations in geraniol production, these yeasts exhibit promising metabolic traits that can be further explored in future metabolic engineering strategies aimed at the efficient use of renewable feedstocks and the sustainable production of high value-added compounds.