Envolvimento do microambiente tumoral na resposta ao efeito citotóxico dos compostos de coordenação sobre células de linhagem de linfoma de Burkitt

Abstract

O linfoma de Burkitt (LB) é uma neoplasia hematológica de células B, do tipo nãoHodgkin, originadas no centro germinativo dos linfonodos. A resistência aos quimioterápicos e a elevada toxicidade das terapias disponíveis representam desafios importantes, especialmente em pacientes idosos e imunocomprometidos. Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito citotóxico de compostos de coordenação e a influência do microambiente tumoral na resposta celular. A citotoxicidade de oito compostos de coordenação de cobre (II, 1-4) e platina (II, 6- 9) foi avaliada em células da linhagem de linfoma de Burkitt (Daudi) por meio do ensaio colorimétrico de MTT, em diferentes concentrações (1-100 µM) e tempos de incubação (24, 48 e 72 h). A concentração inibitória de 50% (CI50) foi determinada por regressão linear. O composto 3 apresentou CI50 de 3,72 ± 0,17 µM (24 h), 3,26 ± 0,27 µM (72 h) e 6,42 ± 0,48 µM (48 h). O composto 6 apresentou CI50 de 74,05 ± 2,70 µM (24 h), 10,46 ± 0,40 µM (48 h) e 5,15 ± 0,46 µM (72 h). Para o composto 8, os valores de CI50 foram de 6,90 ± 0,39 µM (24 h), 32,14 ± 1,42 µM (48 h) e 15,37 ± 0,50 µM (72 h). Já o composto 9 apresentou CI50 de 46,39 ± 2,01 µM (24 h), 72,24 ± 4,30 µM (48 h) e 11,68 ± 1,43 µM (72 h). Os compostos também foram avaliados em células de fibroblasto de medula óssea (HS-5), nas quais induziram citotoxicidade dependente da concentração. Os compostos 3 e 6 apresentaram efeito independente do tempo, enquanto os compostos 8 e 9 mostraram dependência tanto da concentração quanto do tempo. Nos ensaios de hemólise, os compostos 3 e 9 não induziram lise eritrocitária em concentrações até dez vezes superiores à CI50. E os compostos 6 e 8 não apresentaram efeito hemolítico até 7,5 e 5 vezes a CI50 de 24 h, respectivamente. Com base nesses resultados, os compostos 6 e 8 foram selecionados para os ensaios de cocultivo. No modelo de cocultivo, os compostos 6 e 8 promoveram aumento da citotoxicidade tanto nas células tumorais quanto nas células HS-5. A análise morfológica evidenciou sinais compatíveis com apoptose inicial e tardia. Além disso, os compostos 3, 6 e 8 induziram a externalização de fosfatidilserina, confirmando a ativação do processo apoptótico, tanto em cultivo isolado quanto, para os compostos 6 e 8, após o cocultivo. Os compostos induzem apoptose pela via intrínseca, evidenciada pelo aumento da razão da expressão de Bax/Bcl-2 (compostos 3, 6 e 8 em cultivo isolado e composto 6 em cocultivo), aumento da expressão de AIF, perda do potencial de membrana mitocondrial (??m) e ativação da caspase-3. Além disso, os compostos 6 e 8 também ativaram a via extrínseca da apoptose, uma vez que promoveram aumento da expressão de FasR. Observou-se ainda redução da expressão de Ki-67 e da proteína survivina, marcador associado à proliferação celular e à resistência a quimioterápicos. Em conjunto, os resultados demonstram que os compostos avaliados induzem morte celular por apoptose intrínseca e extrínseca, com envolvimento mitocondrial e ativação de caspases, além de interferirem em vias associadas à resistência tumoral. Esses achados indicam que os compostos, especialmente os compostos 6 e 8, apresentam potencial promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento do linfoma de Burkitt.

Abstract: Burkitt lymphoma (BL) is a hematological malignancy of B cells, classified as a nonHodgkin lymphoma, originating from germinal center B cells in lymph nodes. Resistance to chemotherapeutic agents and the high toxicity of currently available therapies represent important challenges, especially in elderly and immunocompromised patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate the cytotoxic effect of coordination compounds and the influence of the tumor microenvironment on the cellular response. The cytotoxicity of eight coordination compounds of copper (II, 1?4) and platinum (II, 6?9) was evaluated in Burkitt lymphoma cell line (Daudi) using the colorimetric MTT assay at different concentrations (1-100 µM) and incubation times (24, 48, and 72 h). The half maximal inhibitory concentration (IC50) was determined by linear regression. Compound 3 showed IC50 values of 3.72 ± 0.17 µM (24 h), 3.26 ± 0.27 µM (72 h), and 6.42 ± 0.48 µM (48 h). Compound 6 presented IC50 values of 74.05 ± 2.70 µM (24 h), 10.46 ± 0.40 µM (48 h), and 5.15 ± 0.46 µM (72 h). For compound 8, IC50 values were 6.90 ± 0.39 µM (24 h), 32.14 ± 1.42 µM (48 h), and 15.37 ± 0.50 µM (72 h). Compound 9 showed IC50 values of 46.39 ± 2.01 µM (24 h), 72.24 ± 4.30 µM (48 h), and 11.68 ± 1.43 µM (72 h). The compounds were also evaluated in bone marrow fibroblast cells (HS-5), in which they induced concentration-dependent cytotoxicity. Compounds 3 and 6 showed a time-independent effect, whereas compounds 8 and 9 exhibited both concentration- and time-dependent effects. In hemolysis assays, compounds 3 and 9 did not induce erythrocyte lysis at concentrations up to ten times higher than their IC50 values. Compounds 6 and 8 did not show hemolytic effects up to 7.5 and 5 times the 24 h IC50, respectively. Based on these results, compounds 6 and 8 were selected for co-culture assays. In the co-culture model, compounds 6 and 8 promoted increased cytotoxicity in both tumor cells and HS-5 cells. Morphological analysis revealed features compatible with early and late apoptosis. In addition, compounds 3, 6, and 8 induced phosphatidylserine externalization, confirming activation of the apoptotic process, both in isolated culture and, for compounds 6 and 8, after co-culture. The compounds induced apoptosis through the intrinsic pathway, evidenced by the increased Bax/Bcl-2 expression ratio (compounds 3, 6, and 8 in isolated culture and compound 6 in co-culture), increased AIF expression, loss of mitochondrial membrane potential (??m), and activation of caspase-3. Furthermore, compounds 6 and 8 also activated the extrinsic apoptotic pathway, as indicated by increased FasR expression. A reduction in the expression of Ki-67 and the protein survivin was also observed, markers associated with cell proliferation and resistance to chemotherapeutic agents. Taken together, these results demonstrate that the evaluated compounds induce cell death through both intrinsic and extrinsic apoptotic pathways, involving mitochondrial dysfunction and caspase activation, in addition to interfering with pathways associated with tumor resistance. These findings indicate that the compounds, particularly compounds 6 and 8, show promising potential for the development of new therapeutic strategies for the treatment of Burkitt lymphoma.