Avaliação da influência do bisglicinato ferroso na replicação, virulência e infectividade viral

Abstract

A anemia ferropriva permanece um problema relevante de saúde pública em crianças, principalmente em países em desenvolvimento, com o Brasil implementando o Programa Nacional de Suplementação de Ferro que recomenda 1 mg/kg/dia de ferro elementar para crianças entre 6 e 24 meses. Concomitantemente, infecções virais entéricas causadas por rotavírus A (RVA) e adenovírus humano (HAdV) representam importantes causas de gastroenterite aguda nesta população. Apesar da sobreposição temporal entre o período recomendado para suplementação ferro e a faixa etária mais afetada por infecções entéricas, poucos estudos avaliam diretamente como a disponibilidade de ferro influencia a infectividade e replicação destes vírus. Este estudo investigou in vitro o impacto da suplementação com bisglicinato ferroso na infectividade, virulência e replicação viral de HAdV-5 (modelo respiratório) e RVA (modelo entérico). Os experimentos foram conduzidos utilizando células A549 e MA-104 permissivas, respectivamente, para adenovírus e rotavírus, expostas a diferentes concentrações de bisglicinato ferroso Neutrofer® (750, 218,8 e 109,4 µg/mL). A citotoxicidade foi determinada pelo ensaio com sulforodamina B, permitindo calcular a CC50 (concentração citotóxica 50%). Inicialmente, os ensaios de interação vírus-ferro foram realizados em três modalidades para padronização do método de análise utilizando HAdV como modelo experimental: pré-exposição (exposição sequencial de células a ferro ou vírus), exposição conjunta (contato simultâneo) e reinfecção viral (prole viral). Após padronizado, para o modelo viral de RVA foi escolhido o método de pré-exposição para seguimento dos estudos. A replicação viral foi quantificada através de RT-qPCR integrada a cultura celular (ICC-RT-qPCR), enquanto a viabilidade celular foi avaliada por contagem celular e citometria de fluxo. O efeito citopático foi observado por microscopia óptica invertida e quantificado a área das unidades formadoras de placas (UFP). Para HAdV-5, os resultados demonstraram que o ferro não promoveu aumento estatisticamente significativo nas cópias genômicas virais, mas foi associada à maior efeito citopático, maior lise do tapete celular e aumento de morte celular detectada por citometria. Para RVA, a suplementação de ferro modulou a replicação viral nas células pré-tratadas com a suplementação. Apesar do aumento da carga genômica de RVA, não houve redução estatisticamente significativa da viabilidade celular nem expansão mensurável da área de efeito citopático calculado. Os achados indicam que a suplementação com bisglicinato ferroso em concentrações compatíveis com as recomendações clínicas aumenta a replicação, infectividade e virulência de adenovírus humano tipo 5 e rotavírus A in vitro. Estas descobertas sugerem que a disponibilidade de ferro pode aumentar a susceptibilidade a infecções virais gastroentéricas e respiratórias, modulando de maneira distinta a infectividade em ambos os vírus e a replicação (RVA) e virulência (HAdV-5) viral. Os resultados ressaltam a necessidade de estudos em modelos tridimensionais e posteriormente clínicos para avaliar se a suplementação de ferro durante períodos de risco de infecções virais gastroentéricas requer ajustes nas doses ou protocolos de administração, visando otimizar a prevenção de anemia sem potencializar a susceptibilidade a infecções virais.

Abstract: Iron deficiency anemia remains a significant public health problem in children, particularly in developing countries. Brazil has implemented the National Iron Supplementation Program, which recommends 1 mg/kg/day of elemental iron for children aged 6 to 24 months. Concomitantly, enteric viral infections caused by rotavirus A (RVA) and human adenovirus (HAdV) represent important causes of acute gastroenteritis in this population. Despite the temporal overlap between the recommended period for iron supplementation and the age group most affected by enteric infections, few studies directly assess how iron availability influences the infectivity and replication of these viruses. This study investigated the in vitro impact of ferrous bisglycinate supplementation on the infectivity, virulence, and viral replication of HAdV-5 (an infection model) and RVA (an enteric model). The experiments were conducted using permissive A549 and MA-104 cells, respectively, for adenovirus and rotavirus, exposed to different concentrations of Neutrofer® ferrous bisglycinate (750, 218.8, and 109.4 µg/mL). Cytotoxicity was determined using the sulforhodamine B assay, which allowed for the calculation of the CC50 (cytotoxic concentration 50%). Initially, virus-iron interaction assays were performed in three modalities to standardize the analytical method using HAdV as an experimental model: pre-exposure (sequential exposure of cells to iron or virus), concurrent exposure (simultaneous contact), and viral reinfection (viral progeny). After standardization, the pre-exposure method was chosen for the RVA viral model to continue the studies. Viral replication was quantified using RT-qPCR integrated with cell culture (ICC-RT-qPCR), while cell proliferation was evaluated by cell collection and flow cytometry. The cytopathic effect was presented by inverted optical microscopy and quantified in the area of ??plaque-forming units (PFU). For HAdV-5, the results demonstrated that iron did not promote a statistically significant increase in suspected viral genomics; however, it was associated with a greater cytopathic effect, increased lysis of the cell carpet, and increased cell death, as detected by cytometry. For RVA, iron supplementation modulated viral replication in cells that had been pre-treated with the supplement. Despite the increase in the genomic load of RVA, there was no statistically significant reduction in cell prediction or measurable expansion of the calculated cytopathic effect area. The results indicate that supplementation with ferrous bisglycinate in specifications compatible with clinical recommendations increases the replication, infectivity, and virulence of human adenovirus type 5 and rotavirus A in vitro. These findings suggest that iron availability may increase susceptibility to gastroenteric and respiratory viral infections, distinctly modulating infectivity in both viruses and viral replication (RVA) and virulence (HAdV-5). The results highlight the need for studies using three-dimensional models and subsequent clinical trials to assess whether iron supplementation during periods of risk for gastrointestinal viral infections requires adjustments in dosage or administration protocols, thereby improving anemia prevention without increasing susceptibility to viral infections.