Implantação do cultivo de Chlamydia trachomatis para produção de painéis de controle externo de qualidade

Abstract

Chlamydia trachomatis (CT) é uma bactéria intracelular obrigatória responsável por uma das infecções sexualmente transmissíveis mais comuns no mundo. O cultivo celular desta bactéria é empregado para fins de pesquisa, porém o diagnóstico se dá pelo uso de testes moleculares, como a PCR em tempo real. No Brasil, a RDC nº 978 de 6 de junho de 2025 preconiza a implementação de gestão do controle da qualidade (tanto interno quanto externo) em exames de análises clínicas. O Programa de Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) para os testes de diagnóstico molecular de Neisseria gonorrhoeae/Chlamydia trachomatis (CT/NG) é um exemplo disso, uma parceria entre o Ministério da Saúde e o Laboratório de Biologia Molecular, Microbiologia e Sorologia (LBMMS), que utiliza amostras liofilizadas detectadas e não detectadas para as duas bactérias. O objetivo deste trabalho foi a cultura celular de CT no LBMMS, para padronizar a carga bacteriana de CT para os painéis de AEQ CT/NG e para isolamento de CT a partir de amostras clínicas. Foram estabelecidos parâmetros para o cultivo celular de CT (temperatura, meio de cultivo e uso de cicloheximida), foram padronizadas PCRs convencionais para detecção do 23S do RNAr de CT para monitorar a contaminação das culturas celulares por Mycoplasma spp. Duas amostras clínicas previamente triadas para CT foram incluídas no estudo, o isolamento ocorreu conforme a infecção celular padronizada. Para estabelecer a carga bacteriana para os painéis AEQ CT/NG, primeiramente duas placas com células McCoy B foram preparadas e diluições de CT ATCC H (Strain: UW-43) nas razões 10-3, 10-6 e 10-9 foram adicionadas nas cavidades, a fim de entender o crescimento bacteriano. Para realizar testes de estabilidade da bactéria nos painéis AEQ CT/NG, uma solução estoque foi diluída nas proporções 10-3, 10-6 e 10-9 com base de PBS + 4% de albumina bovina e submetidas a processo de liofilização. A estabilidade dos liofilizados foi testada nos dias 1, 21, 30 e 60 após a liofilização, nos equipamentos Cobas 5800®, GeneXpert® e Bio-Rad CFX96®. Como resultados, não foi possível isolar CT a partir de amostras clínicas com a metodologia testada, sendo evidenciado pela falta de inclusões nas placas. Nas duas placas infectadas com diluições de CT, os valores de Cq da PCR em tempo real apresentaram grande variação, visto a variabilidade biológica intrínseca ao processo de cultivo. No teste de estabilidade dos liofilizados, a diluição 10-3 demonstrou melhor reprodutibilidade e estabilidade nos três equipamentos, mesmo após 60 dias. O sistema GeneXpert® apresentou, de forma consistente, médias de Cq inferiores, em comparação aos outros equipamentos testados, sugerindo uma sensibilidade maior e um limite de detecção menor. A diluição 10-3 será utilizada no painel prático de AEQ CT/NG em 2026.

Abstract: Chlamydia trachomatis (CT) is an obligate intracellular bacterium responsible for one of the most common sexually transmitted infections in the world. Cell culture of this bacterium is used for research purposes, but diagnosis is made using molecular tests, such as real-time PCR. In Brazil, RDC No. 978 of June 6, 2025 recommends the implementation of quality control management (both internal and external) in clinical analysis tests. The External Quality Assessment Program (AEQ) for molecular diagnostic tests for Neisseria gonorrhoeae/Chlamydia trachomatis (CT/NG) is an example of this, a partnership between the Ministry of Health and the Laboratory of Molecular Biology, Microbiology, and Serology (LBMMS), which uses detected and undetected lyophilized samples for both bacteria. The objective of this study was to culture CT cells at the LBMMS in order to standardize the CT bacterial load for the CT/NG EQA panels and for CT isolation from clinical samples. Parameters were established for CT cell culture (temperature, culture medium, and use of cycloheximide), and conventional PCRs were standardized for the detection of CT 23S rRNA to monitor contamination of cell cultures by Mycoplasma spp. Two clinical samples previously screened for CT were included in the study, and isolation occurred according to standardized cell infection. To establish the bacterial load for the AEQ CT/NG panels, two plates with McCoy B cells were first prepared, and dilutions of CT ATCC H (Strain: UW-43) at ratios of 10?³, 10?6, and 10?? were added to the wells in order to understand bacterial growth. To perform bacterial stability tests on AEQ CT/NG panels, a stock solution was diluted in proportions of 10-3, 10-6, and 10-9 based on PBS + 4% bovine albumin and subjected to a lyophilization process. The stability of the lyophilized samples was tested on days 1, 21, 30, and 60 after lyophilization using Cobas 5800®, GeneXpert®, and Bio-Rad CFX96® equipment. As a result, it was not possible to isolate CT from clinical samples using the tested methodology, as evidenced by the lack of inclusions in the plates. In the two plates infected with CT dilutions, the real-time PCR Cq values showed great variation, given the biological variability intrinsic to the culture process. In the freeze dried stability test, the 10-3 dilution showed better reproducibility and stability in the three devices, even after 60 days. The GeneXpert® system consistently showed lower Cq averages compared to the other devices tested, suggesting greater sensitivity and a lower detection limit. The 10-3 dilution will be used in the practical AEQ CT/NG panel in 2026.