Imunossensor eletroquímico impresso em 3D galvanizado para determinação de TNF-alfa: um biomarcador de doença inflamatória intestinal

Abstract

O fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) é uma citocina pró-inflamatória central na fisiopatologia das doenças inflamatórias intestinais e de outras condições crônicas de inflamação. Sua quantificação em amostras clínicas apresenta grande relevância para o monitoramento da atividade inflamatória e da resposta a terapias baseadas em anticorpos monoclonais anti-TNF-alfa, como o infliximabe. Nesse contexto, o desenvolvimento de plataformas analíticas sensíveis, seletivas e de baixo custo é essencial para ampliar a acessibilidade a métodos de acompanhamento clínico. Neste trabalho, foi desenvolvido um imunossensor eletroquímico miniaturizado, impresso em 3D e galvanizado com ouro para a determinação do antígeno TNF-alfa em soro sanguíneo humano. O dispositivo foi produzido utilizando três tipos de filamentos: Cu/PLA-CB, aplicado na construção do eletrodo de trabalho, PLA-CB para o contra-eletrodo e o eletrodo de pseudo-referência, e o filamento de ABS, empregado como suporte estrutural. Inicialmente, os sensores foram submetidos à ativação eletroquímica em solução de KOH 1,0 mol L-1, sob aplicação de potencial de +1,8 V por 900 s, a fim de expor os sítios condutores de Cu e CB presentes na matriz polimérica. Em seguida, realizou-se a galvanização da superfície do eletrodo de trabalho com solução de HAuCl4 5,0 mmol L-1 por 5 min, processo espontâneo possibilitado pela diferença de potenciais padrão entre Cu e Au. A deposição de Au viabilizou a formação subsequente de monocamadas auto organizadas (SAMs) a partir do ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA), que serviram como intermediário para a imobilização covalente do anticorpo infliximabe por meio do sistema EDC/NHS. As caracterizações físico-químicas e eletroquímicas, realizadas por SEM, XPS, EIS e voltametria cíclica, confirmaram a deposição uniforme de Au, a redução da resistência à transferência de carga e a eficiência da funcionalização da superfície, assegurando maior estabilidade e seletividade para o reconhecimento biomolecular. Na etapa de otimização experimental, foram avaliados parâmetros das técnicas eletroanalíticas, sendo a voltametria de pulso diferencial (DPV) selecionada como a mais adequada. As condições otimizadas incluíram velocidade de varredura de 50 mV s-1, amplitude de pulso de 240 mV, tempo de pulso de 10 ms e incremento de 10 mV, resultando em maior intensidade e reprodutibilidade das respostas de corrente. A curva de calibração obtida para concentrações de TNF-alfa entre 0,15 e 10 pg mL-1 apresentou correlação linear com coeficiente de correlação de 0,999. O método demonstrou alta sensibilidade (0,95 µA mL pg-1) e limites de detecção e quantificação de 0,04 e 0,15 pg mL-1, respectivamente. Esses parâmetros permitem quantificar esse biomarcador dentro da faixa considerada normal em indivíduos saudáveis (0,20?8,0 pg mL-1). O imunossensor demonstrou elevada precisão, com valores de RSD de 3,0% em ensaios intradia e 14% em ensaios interdias, ambos inferiores aos limites de Horwitz, além de alta seletividade frente a potenciais interferentes do soro, registrando variações de corrente inferiores a 10%. Nos ensaios de adição e recuperação em matriz de soro sanguíneo humano, as taxas variaram entre 97 e 117%, compatíveis com os critérios de aceitação da literatura para concentrações ultrabaixas, que indicam faixa de 40 a 120% de recuperação. Os resultados obtidos evidenciam o potencial do imunossensor eletroquímico impresso em 3D galvanizado como uma plataforma analítica de baixo custo, reprodutível e altamente sensível, apta para aplicação em análises clínicas voltadas ao monitoramento de TNF-alfa.

Abstract: Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) is a pro-inflammatory cytokine that plays a central role in the pathophysiology of inflammatory bowel diseases and other chronic inflammatory conditions. Its quantification in clinical samples is highly relevant for monitoring inflammatory activity and the response to therapies based on anti-TNF-alpha monoclonal antibodies, such as infliximab. In this context, the development of sensitive, selective, and low-cost analytical platforms is essential to broaden access to clinical monitoring methods. In this work, a miniaturized electrochemical immunosensor, fabricated by 3D printing and gold electroplating, was developed for the determination of the TNF-alpha antigen in human blood serum. The device was produced using three types of filaments: Cu/PLA-CB, employed in the construction of the working electrode; PLA-CB for the counter electrode and pseudo-reference electrode; and ABS filament, used as the structural support. Initially, the sensors were subjected to electrochemical activation in 1.0 mol L-1 KOH solution under an applied potential of +1.8 V for 900 s, in order to expose the conductive sites of Cu and carbon black (CB) present in the polymeric matrix. Subsequently, the surface of the working electrode was electroplated with a 5.0 mmol L-1 HAuCl4 solution for 5 min, a spontaneous process enabled by the difference in standard potentials between Cu and Au. The deposition of Au enabled the subsequent formation of self assembled monolayers (SAMs) from 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA), which served as an intermediate for the covalent immobilization of the infliximab antibody via the EDC/NHS coupling system. Physicochemical and electrochemical characterizations performed by SEM, XPS, EIS, and cyclic voltammetry confirmed the uniform deposition of Au, the reduction in charge-transfer resistance, and the efficiency of surface functionalization, ensuring greater stability and selectivity for biomolecular recognition. During the experimental optimization stage, parameters of electroanalytical techniques were evaluated, and differential pulse voltammetry (DPV) was selected as the most suitable method. The optimized conditions included a scan rate of 50 mV s-1, pulse amplitude of 240 mV, pulse time of 10 ms, and step increment of 10 mV, resulting in higher current intensity and improved reproducibility of the responses. The calibration curve obtained for TNF-alpha concentrations ranging from 0.15 to 10 pg mL-1 exhibited linear correlation with a correlation coefficient of 0.999. The method demonstrated high sensitivity (0.95 µA mL pg-1) and limits of detection and quantification of 0.04 and 0.15 pg mL-1, respectively. These parameters allow quantification of this biomarker within the range considered normal in healthy individuals (0.20?8.0 pg mL-1). The immunosensor exhibited high precision, with relative standard deviation (RSD) values of 3.0% for intraday assays and 14% for interday assays, both below the Horwitz limits, as well as high selectivity toward potential serum interferents, with current variations below 10%. In spike and-recovery assays performed in human blood serum matrix, recovery rates ranged from 97 to 117%, consistent with literature acceptance criteria for ultralow concentrations, which indicate a recovery range of 40?120%. The results demonstrate the potential of the gold-electroplated, 3D-printed electrochemical immunosensor as a low-cost, reproducible, and highly sensitive analytical platform suitable for clinical analyses aimed at TNF-alpha monitoring.