Efeitos da radiação ultravioleta B em embriões e larvas do camarão de água-doce Macrobrachium olfersii: análises morfológicas, celulares e moleculares

Abstract

Os níveis de radiação ultravioleta B (UVB) estão aumentando na superfície terrestre devido às alterações na camada de ozônio. Como resultado, os ambientes aquáticos estão cada vez mais expostos a essa radiação, que tem capacidade de induzir danos nos organismos que habitam e se reproduzem nesses ambientes. Os danos mais conhecidos da radiação UVB em organismos aquáticos incluem alterações morfológicas externas e a formação de dímeros de timina nas moléculas de DNA. Além do DNA, também tem sido demonstrado que as mitocondrias são alvo dessa radiação, resultando em alterações na dinâmica mitocondrial. Macrobrachium olfersii, um camarão de água doce, habita e se reproduz em águas claras e rasas, desempenhando um papel crucial na ciclagem de energia dos ambientes aquáticos, onde os comprimentos de onda da radiação UVB penetram facilmente. As fêmeas carregam os ovos em uma câmara incubadora ventral e externa, o que facilita a exposição dos ovos à radiação UVB durante o desenvolvimento embrionário. As larvas, que são livres-natantes, também estão sujeitas a essa exposição. Nos estágios embrionário e larval de M. olfersii não são conhecidos mecanismos de defesa completamente desenvolvidos, tornando-os mais suscetíveis aos danos causados pela radiação UVB. Considerando o panorama apresentado, o objetivo desta tese foi avaliar os efeitos da radiação UVB na indução à mitofagia nas células embrionárias e larvais de M. olfersii, bem como analisar as alterações morfológicas, comportamentais e respostas celulares associadas ao dano ao DNA, apoptose e proliferação celular nas células larvais. A partir do transcriptoma dos embriões de M. olfersii, foi realizada a identificação das sequências codificantes dos genes associados ao processo mitofágico (autofagia seletiva de mitocondrias danificadas), incluindo Pink1, Prkn, Sqstm1, Map1lc3, Tomm20 e Opa1. Os resultados obtidos através da RT-qPCR para a quantificação dos níveis de transcritos desses genes em embriões demonstraram que eles são altamente regulados ao longo do desenvolvimento. Já a quantificação dos transcritos dos mesmos genes em embriões expostos à radiação UVB revelou um aumento significativo em 6 horas após a exposição. A quantificação do número de células positivas para as proteínas PINK1 (indutora de mitofagia), SQSTM/p62 (adaptadora LC3B), LC3B (membrana de autofagossoma) e TOM20 (membrana mitocondrial externa) demonstrou um aumento significativo em 12 horas após a exposição à radiação UVB nas células embrionárias. Nas células larvais expostas à radiação UVB, também foi observado um aumento no número de células positivas para as proteínas PINK1, SQSTM1/p62, LC3B e TOM20, além de um aumento no número de células positivas para dímeros de timina (dano ao DNA) e caspase3 (apoptose). Adicionalmente, houve diminuição no número de células positivas para proliferação celular (PHH3). Além das respostas celulares, as larvas também apresentaram alterações morfológicas, como mudanças na transparência e no tamanho corporal (cefalotórax e abdômen), alterações no índice do olho e no comportamento de fototropismo positivo. Com base nos resultados obtidos, pode-se afirmar que as células embrionárias e larvais de M. olfersii, quando expostas à radiação UVB, regulam diferentes processos moleculares e celulares para mitigar os danos causados por essa radiação. Adicionalmente, as alterações morfológicas induzidas pela UVB nas larvas podem comprometer o desenvolvimento e sobrevivência de M. olfersii, afetando consequentemente a população desse organismo nos ambientes naturais.

Abstract: Ultraviolet B (UVB) radiation levels are increasing at the Earth's surface due to changes in the ozone layer. As a result, aquatic environments are increasingly exposed to this radiation, which has the potential to demage the organisms that inhabit and reproduce in these ecosystems. The most well-known damages of UVB radiation to aquatic organisms include external morphological changes and the formation of thymine dimers in DNA molecules. In addition to DNA, it has been demonstrated that mitochondria are also targets of this radiation, leading to alterations in mitochondrial dynamics. Macrobrachium olfersii, a freshwater prawn, lives and reproduces in clear, shallow waters, playing a crucial role in the energy cycle of aquatic environments, where wavelengths of UVB radiation easily penetrate. Females carry their eggs in a ventral, external brood pouch, which increases the eggs' exposure to UVB radiation during embryonic development. Additionally, the free-swimming larvae are also subjected to this exposure. During the embryonic and larval stages of M. olfersii, defense mechanisms are not fully developed, making them more susceptible to damage caused by UVB radiation. Given this context, the aim of this thesis was to evaluate the effects of UVB radiation on the induction of mitophagy in embryonic and larval cells of M. olfersii, as well as to analyze the morphological, behavioral changes and cellular responses related to DNA damage, apoptosis and cell proliferation in larval cells. Using the transcriptome of M. olfersii embryos, the coding sequences of genes associated with the mitophagic process (selective autophagy of damaged mitochondria) were identified, including Pink1, Prkn, Sqstm1, Map1lc3, Tomm20 and Opa1. The results obtained through RT-qPCR to quantify the transcription levels of these genes in embryos demonstrated that they are highly regulated throughout development. Quantification of transcripts of the same genes in embryos exposed to UVB radiation revealed a significant increase 6 hours after exposure. Quantification of the number of cells positive for the proteins PINK1 (mitophagy inducer), SQSTM/p62 (LC3B adapter), LC3B (autophagosomal membrane) and TOM20 (outer mitochondrial membrane) demonstrated a significant increase within 12 hours after exposure to UVB radiation in embryonic cells. In larval cells exposed to UVB radiation, an increase in the number of cells positive for PINK1, SQSTM1/p62, LC3B and TOM20 proteins was also demonstrated, in addition to an increase in the number of cells positive for thymine dimers (DNA damage) and caspase3 (apoptosis). Additionally, there was a decrease in the number of cells undergoing proliferation (PHH3). Beyond cellular responses, the larvae also displayed morphological changes, including alterations in transparency and body size (cephalothorax and abdomen), variations in the eye index, and changes in positive phototropism behavior. Based on the results obtained, it can be stated that the embryonic and larval cells of M. olfersii, when exposed to UVB radiation, regulate different molecular and cellular processes to mitigate the damage caused by this radiation. Additionally, the UVB-induced morphological changes in the larvae may compromise the development and survival of M. olfersii, consequently affecting the population of this organism in natural environments.