Efeitos da exposição ao inseticida piriproxifeno sobre o desenvolvimento da medula espinhal e vértebras em embriões de Gallus domesticus

Abstract

Piriproxifeno (PPF) é um composto sintético análogo ao hormônio juvenil de insetos, utilizado como um inseticida de amplo espectro. O PPF tem demonstrado eficiência como regulador do crescimento de moscas domésticas, larvas de mosquitos, formigas, pulgas e carrapatos, além de organismos indesejados na agricultura. No Brasil, o uso desse composto foi introduzido em 2014 para o controle populacional de mosquitos vetores de doenças, sendo aplicado em reservatórios de água potável na concentração de 0,01 mg/L, de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) e do Ministério da Saúde. Devido ao período em que foi inserido nas ações de saúde pública no Brasil ter coincidido com o subsequente surto de microcefalia congênita associada ao Zika vírus, foram levantados questionamentos acerca da segurança do uso do PPF e seu consumo pela população. Assim, neste trabalho, propõe-se avaliar o potencial de toxicidade do PPF sobre o desenvolvimento do sistema nervoso central, especificamente da medula espinhal e vértebras, utilizando embriões de Gallus domesticus, como modelo de estudo. Duas concentrações foram avaliadas: 0,01 mg/L e 10 mg/L de PPF. Para o grupo controle, os embriões receberam apenas as soluções utilizadas na diluição do PPF (solução salina 0,9% + DMSO). Os embriões foram expostos uma única vez no primeiro dia embrionário (E1) e avaliados no décimo dia de desenvolvimento (E10). Análises histológicas, histoquímicas e moleculares foram realizadas para avaliar os efeitos da exposição ao PPF. Em análises morfométricas não foram observadas diferenças entre os grupos em relação ao diâmetro do corpo das vértebras e na espessura da medula espinhal, exceto a camada do manto que apresentou aumento no grupo exposto a 10 mg/L PPF. Reações histoquímicas se apresentaram reduzidas para polissacarídeos ácidos (alcian blue) nas duas concentrações e aumentadas em proteoglicanos ácidos (azul de toluidina) na matriz cartilaginosa do grupo exposto a 0,01 mg/L. A avaliação de componentes neutros (periodic-acid Schiff) no corpo das vértebras apresentou resultados diferentes entre os grupos, com diminuição no grupo exposto a 0,01 mg/L e aumento no grupo exposto a 10 mg/L PPF. Em relação à medula espinhal, foi observado um aumento na reação a componentes ácidos (azul de toluidina) na camada do manto (nos dois grupos) e na camada marginal (0,01 mg/L PPF). A reação de componentes neutros se apresentou diminuída em ambos os grupos na camada ependimária e ainda nas camadas manto e marginal no grupo exposto a 10 mg/L PPF. Em relação ao conteúdo de proteínas, somente o grupo exposto a menor concentração apresentou reação diminuída em relação ao controle, sendo estas nas camadas ependimária e manto. A análise de diferenciação neuronal por imuno-histoquímica para ß-tubulina III revelou diminuição em ambos os grupos expostos nas camadas ependimária e manto, embora não tenham sido observadas diferenças no nível de transcritos analisados por RT-qPCR. Deste modo, foi possível observar que a exposição ao PPF causou alterações nos componentes ácidos e neutros na matriz cartilaginosa e na medula espinhal, além de influenciar negativamente na diferenciação neuronal. Por fim, a análise integrada de biomarcadores indicou os componentes ácidos e neutros, assim como a diferenciação neuronal como os que melhor responderam aos insultos de toxicidade causados pelo PPF durante o desenvolvimento embrionário.

Abstract: Pyrproxyfen (PPF) is a synthetic juvenile hormone analog of insects, used as a broad-spectrum insecticide. PPF has shown effectiveness as a growth regulator of houseflies, mosquito larvae, ants, fleas, ticks, and damaging organisms in agriculture. In Brazil, PPF was introduced in 2014 for mosquito population control, being applied to drinking water reservoirs at a concentration of 0.01 mg/L, according to recommendations from the World Health Organization (WHO). However, due to the period in which it was implemented in public health actions in Brazil coinciding with the subsequent outbreak of congenital microcephaly associated with the Zika virus, questions were raised about the safety of PPF application and its consumption by the population. In this study, it was proposed to evaluate the potential toxicity of PPF in the development of the central nervous system, precisely the spinal cord and vertebrae of Gallus domesticus embryos as the experimental model. Two concentrations were assessed: 0.01 mg/L and 10 mg/L of PPF. For the control group, embryos received only the solutions used in PPF dilution (0.9% saline solution + DMSO). The embryos were exposed once on the first embryonic day (E1) and evaluated on the tenth day of development (E10). Histological, histochemical, and molecular analyses were performed to assess the effect of PPF exposure. In the morphometric analyses, no differences were observed between groups regarding vertebral body diameter and spinal cord thickness, except in the mantle layer, which showed an increase in the group exposed to 10 mg/L of PPF. Histochemical reactions were reduced for acid polysaccharides (alcian blue) in both concentrations and increased for acid proteoglycans (toluidine blue) in the cartilage matrix of the group exposed to 0.01 mg/L. The evaluation of neutral components (periodic-acid Schiff) in the vertebral body showed different results between groups, with a decrease in the group exposed to 0.01 mg/L and an increase in the group exposed to 10 mg/L of PPF. Regarding the spinal cord, an increased reaction to acid components (toluidine blue) was observed in the mantle layer (in both groups) and the marginal layer (0.01 mg/L of PPF). The reaction of neutral components decreased in both groups in the ependymal layer, and in the mantle and marginal layers only in the group exposed to 10 mg/L of PPF. Regarding the protein content, only the group exposed to the lowest concentration showed a decreased reaction compared to the control, in the ependymal and mantle layers. Analysis of neuronal differentiation by immunohistochemistry for ß-tubulin III revealed a decrease in both exposed groups in the ependymal and mantle layers, although no differences were observed in the transcript level analyzed by RT-qPCR. Thus, it was observed that exposure to PPF caused alterations in the acid and neutral components in the cartilage matrix and spinal cord, negatively influencing neuronal differentiation. The integrated analysis of biomarkers indicated the acid and neutral components and neuronal differentiation as the best indicators of the toxicity induced by PPF during embryonic development.