Metodologias para detecção de modificações no genoma resultantes da tecnologia CRISPR/Cas9

Abstract

A descoberta de manipulação de rDNA (DNA recombinante) em 1973 possibilitou posteriormente desenvolver os Organismos Geneticamente Modificados-OGMs. A tecnologia do DNA recombinante aplicada à agricultura possibilita a modificação gênica para características de interesse em níveis diferentes àqueles obtidos pelo melhoramento clássico. Quarenta anos depois, em 2013, foi descrito que a alteração do DNA por edição genética utilizando Nuclease de Sítio Dirigido (SDN) poderia ser realizada in vitro. A endo-nuclease Cas9, com origem em Streptococcus pyogenes, reconhece uma sequência de três bases de DNA conhecida como motivo NGG, onde o 'N' pode ser qualquer uma das bases (A, T, C ou G), e o 'GG' consiste em duas bases de guanina consecutivas. Uma sequência oligonucleotídica híbrida crRNA/tracrRNA (Trans-activating crRNA (crRNA de ativação em trans) permite a transcrição completa do loco CRISPR tornando então possível guiar e cortar a sequência reconhecida no genoma do organismo alvo. Para o melhoramento de plantas, após a ruptura da dupla fita de DNA, é possível modificar genótipos de acordo com o objetivo do pesquisador. Assim, podem ser visualizadas por exemplo: i) alteração de níveis de expressão de genes; 2) silenciamento, inserções, deleções de genes completos e/ou promotores e/ou regiões de codificação; 3) modificação específica de apenas um nucleotídeo no genoma. A comercialização das inovações no campo biotecnológico agrícola, historicamente são precedidas análise de biossegurança, o que engloba a avaliação de risco (ambiental e saúde humana e animal) anterior a sua comercialização. Dessa forma, as matrizes alimentares com OGM?s estão estabelecidas no mercado quanto sua rotulagem, obtida a partir de métodos analíticos que identifiquem/mensurem a presença do OGM. Considerando a expansão do melhoramento genético a partir de Novas Tecnologias de manipulação do genoma (NGT?s) para obtenção de cultivares com novos traços agronômicos. O objetivo principal desta tese foi investigar as mutações (InDels) na região alvo (on target) como estratégia para identificação, detecção e quantificação de organismos modificados pelo sistema CRISPR/Cas9, considerando as técnicas analíticas atuais. Nossos resultados demostram que a região alvo CPR5 editada de Glycine max é influenciada pelo RNA guia. A técnica de edição tem potencial uso em enriquecimento (através de citometria) para posterior cultivos de células marcadamente editadas. Para a identificação, detecção e quantificação dois tipos de Arabidopsis thaliana resultantes de modificação por CRISPR/Cas9 no gene GRF foram utilizadas. Em um primeiro momento, as regiões foram identificadas por sequenciamento Sanger e confrontadas com dados depositados no NCBI. Em seguida, os primers sintetizados para cada genótipo específico foram utilizados em reações de qPCR. Os ensaios mostraram que, para o genótipo com uma mutação de ponto única (grf1-3), era possível trabalhar estrategicamente a especificidade em qPCR; já para o genótipo grf8-61, a titulação falhou, levando à descontinuação do conjunto de primers. Empiricamente, ao analisar a especificidade do primer com LNA para o genótipo grf1-3 em testes de qPCR, segundo os procedimentos operacionais do ENGL, foi demonstrado que o método foi validado. Os dados mostraram uma que a sequência foi detectável a 0,1% com quantificação de 40 cópias alinhada a parâmetros de robustez e confiança (p>0,5). Os desafios associados à especificidade completa foram revisitados e abordados como forma de ampliar a gama de análises necessárias para garantir uma completa especificidade a nível do evento modificado. A complexidade que a inserção de um único nucleotídeo (1 bp) origina, do ponto de vista da detecção e quantificação de eventos específicos por qPCR, é um obstáculo que deve ser considerado em estudos que focam na análise de nucleotídeos resultantes de modificações. Uma vez que a desregulamentação NGTs e de técnicas de melhoramento inovadoras (TIMPs) tem se tornado uma realidade, é fundamental equilibrar o progresso científico com os potenciais benefícios e os possíveis impactos negativos que organismos modificados podem provocar sobre outros genomas de organismos coexistentes na biodiversidade. Dessa forma, espera-se que os resultados contribuam para o debate sobre a desregulamentação desses organismos, que se traduz na ausência de técnicas de rotulagem e rastreabilidade, a partir de abordagens do ponto de vista analítico que possam contribuir com a análise em biossegurança.

Abstract: The discovery of rDNA manipulation (recombinant DNA) in 1973 later made it possible to develop Genetically Modified Organisms (GMOs). Recombinant DNA technology applied to agriculture is a field that enables gene modification for traits of interest at levels different from those obtained by classical breeding. Forty years later, in 2013, it was described that DNA alteration by gene editing via Site-Directed Nuclease (SDN) could be achieved in vitro. The association of the Cas9 endonuclease (Streptococcus pyogenes) with NGG motif and a hybrid crRNA/tracrRNA oligonucleotide sequence (Trans-activating crRNA) allows the complete transcription of the CRISPR locus, thus making it possible to guide and cut the recognized sequence in the genome of the target organism. For plant breeding, after the rupture of the DNA double-strand, it is possible to modify genotypes according to the researcher's objective. Thus, the following can be visualized, for example i) alteration of gene expression levels; 2) silencing, insertions, deletions of complete genes and/or promoter/coding regions; 3) specific modification of only one nucleotide in the genome. The commercialization of innovations in the agricultural biotechnology field has historically preceded biosafety analysis, which includes risk assessment (environmental and human and animal health) before their commercialization. Thus, food matrices with GMOs are established in the market regarding their labeling, obtained from analytical methods that identify/measure the presence of the GMO?considering the expansion of genetic improvement from New Genome Manipulation Technologies (NGTs) to obtain cultivars with new agronomic traits. The main objective of this thesis was to investigate the target region - ?on target? as a strategy for the identification, detection, and quantification of organisms modified by the CRISPR/Cas9 system, considering current analytical techniques. Our results demonstrate that the edited CPR5 target region of Glycine max is influenced by the project region for guide RNA. The editing technique has potential use in enrichment (through cytometry) for subsequent cultures of markedly edited cells. To work on aspects related to the identification, detection, and quantification, two genotypes of Arabidopsis thaliana resulting from CRISPR/Cas9 modification in the GRF gene were used. Initially, the regions were identified by Sanger sequencing and compared with data deposited in NCBI. Then, the primers synthesized for each specific genotype were used in RT-qPCR reactions. The assays revealed that, for the genotype with a single point mutation (grf1-3), there could be strategic specificity labor in RT-qPCR; for the grf8-61 genotype, titration failed, leading to the discontinuation of the primer set. Empirically, when analyzing the specificity of the LNA primer for the grf1-3 genotype in RT-qPCR tests, according to ENGL operational procedures, it was demonstrated that the method was validated. The data showed a sequence detection of 0.1% and a quantification of 40 copies with trueness and sensitivity p>0,5 X copies. The challenges associated with complete specificity were revisited and addressed in the sense of expanding the range of analyses required to ensure complete specificity at the level of the modified event. The complexity that the insertion of a single nucleotide (1 bp) generates, from the point of view of the detection and quantification of specific events by RT-qPCR, is an obstacle that must be considered in studies that focus on the analysis of nucleotides resulting from modifications. Since the deregulation of NGTs and innovative breeding techniques (TIMPs) has become a reality, it is essential to balance scientific progress with the potential benefits and possible negative impacts that modified organisms can cause on other genomes of organisms coexisting in biodiversity. Thus, it is expected that the results will contribute to the debate on the deregulation of these organisms, which translates into the absence of labeling and traceability techniques, based on approaches from an analytical point of view that can contribute to biosafety analysis.