Desvendando os efeitos ecotoxicológicos do herbicida ácido 2,4-D: biomarcadores bioquímicos, celulares, histopatológicos e comportamentais no peixes-zebra Danio rerio

Abstract

Os agrotóxicos estão entre os principais contaminantes de ecossistemas naturais. O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) foi um dos primeiros herbicidas a serem produzidos e continua sendo amplamente utilizado no mundo. No Brasil, ele é o segundo agrotóxico mais comercializado. Sua ampla utilização vem causando preocupação para o risco de contaminação, especialmente para ecossistemas aquáticos, visto que já tem sido observado a presença de 2,4-D em rios e lagos próximos a lavouras. Nesse sentido, fica claro que organismos aquáticos correm risco de contaminação pelo 2,4-D. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos tóxicos da exposição ao herbicida 2,4-D nas brânquias, encéfalo e comportamento de peixes-zebra (Danio rerio) adultos. Para isso, peixes-zebra foram divididos em 4 grupos: Controle (não expostos ao 2,4-D) e expostos, por 7 dias, às concentrações de 0,03, 0,3 e 3,0 mg/L de 2,4-D. Ao final do período de exposição foram realizadas avaliações comportamentais do teste do tanque novo e teste claro/escuro (NTT e LDT, respectivamente), análise histopatológica (brânquias e telencéfalo), morfológica (brânquias), ultraestrutural (brânquias), estereológica (telencéfalo) e bioquímica (brânquias e encéfalo). Foram observadas alterações morfológicas nas brânquias em todas as concentrações avaliadas, com diminuição no comprimento lamelar, largura do filamento e distância interlamelar, e observou-se aumento na largura das lamelas, com maiores diferenças para os grupos 0,3 e 3,0 mg/L de 2,4-D. A exposição ao 2,4-D provocou diferentes lesões nas brânquias, dentre elas hiperplasia e hipertrofia de células epiteliais pavimentosas (CEP) e células ricas em mitocôndrias (CRM), fusão parcial e total das lamelas, ruptura de CEP, congestão vascular, dilatação do canal marginal e aneurisma, especialmente no grupo 3,0 mg/L de 2,4-D. O Índice de Alterações Histopatológicas (IAH) indicou que peixes expostos a 0,3 e 3,0 mg/L podem apresentar comprometimento funcional/estrutural moderado das brânquias. Alterações ultraestruturais também foram observadas nas brânquias, como danos nas células pilares e danos mitocondriais nas CRM presente nas lamelas. Biomarcadores bioquímicos nas brânquias demonstraram que a exposição a 3,0 mg/L de 2,4-D diminuiu os níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), e aumentou os níveis de nitrito. No encéfalo, a exposição ao 2,4-D não provocou alterações no tecido e nem na quantidade de células estimadas no telencéfalo, porém, a análise bioquímica demonstrou que 3,0 mg/L de 2,4-D diminuiu GSSG e aumentou nitrito. Além disso, em todas as concentrações expostas ao 2,4-D foram observadas diminuição dos níveis de peroxidação lipídica. A análise comportamental na tarefa do NTT demonstrou que a maior concentração testada (3,0 mg/L) modifica o comportamento exploratório de peixes-zebra, diminuindo o número de entradas e tempo de permanência na região superior do aparato. No LDT, a exposição a 3,0 mg/L também comprometeu o comportamento dos animais, aumentando o tempo de permanência e número de entradas na região clara do aparato. Em conjunto esses dados sugerem que o 2,4-D provoca efeitos tóxicos em peixes-zebra, especialmente em concentrações de 3,0 mg/L. A exposição do peixe-zebra ao herbicida 2,4-D em concentrações ambientalmente relevantes e superior mostrou alterações nas brânquias e encéfalo. Todavia, as brânquias indicaram ser órgãos mais sensíveis ao 2,4-D, provavelmente devido ao contato direto com o ambiente contaminado. Nossos resultados oferecem argumentos científicos para que os limites de exposição permitidos ao 2,4-D sejam revistos no Brasil.

Abstract: Pesticides are among the main contaminants of natural ecosystems. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) was one of the first herbicides to be developed and remains widely used worldwide. In Brazil, it is the second most marketed pesticide. Its extensive use has raised concerns about contamination risks, especially for aquatic ecosystems, as the presence of 2,4-D has already been detected in rivers and lakes near agricultural fields. In this context, it is clear that aquatic organisms are at risk of 2,4-D contamination. Thus, the objective of this study was to investigate the toxic effects of exposure to the herbicide 2,4-D on the gills, brain, and behavior of adult zebrafish (Danio rerio). To this end, zebrafish were divided into four groups: Control (not exposed to 2,4-D) and groups exposed for 7 days to concentrations of 0.03, 0.3, and 3.0 mg/L of 2,4-D. At the end of the exposure period, behavioral assessments (Novel Tank Test and Light/Dark Test, NTT and LDT, respectively), histopathological analysis (gills and telencephalon), morphological analysis (gills), ultrastructural evaluation (gills), stereological analysis (telencephalon), and biochemical assays (gills and brain) were performed. Morphological alterations in the gills were observed at all concentrations, including a reduction in lamellar length, filament width, and interlamellar distance, along with an increase in lamellar width, with more pronounced differences in the 0.3 and 3.0 mg/L groups. Exposure to 2,4-D caused various lesions in the gills, such as hyperplasia and hypertrophy of pavement epithelial cells (PECs) and mitochondria-rich cells (MRCs), partial and total lamellar fusion, rupture of PECs, vascular congestion, marginal channel dilation, and aneurysms, especially in the 3.0 mg/L group. The Histopathological Alteration Index (HAI) indicated that fish exposed to 0.3 and 3.0 mg/L may experience moderate functional/structural impairment of the gills. Ultrastructural alterations were also observed in the gills, including damage to pillar cells and mitochondrial damage in MRCs in the lamellae. Biochemical biomarkers in the gills demonstrated that exposure to 3.0 mg/L of 2,4-D decreased levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) and increased nitrite levels. In the brain, 2,4-D exposure did not cause tissue alterations or changes in the estimated number of telencephalic cells. However, biochemical analysis revealed that 3.0 mg/L of 2,4-D decreased GSSG and increased nitrite levels. Additionally, lipid peroxidation levels decreased at all tested concentrations of 2,4-D. Behavioral analysis in the NTT task showed that the highest concentration (3.0 mg/L) altered zebrafish exploratory behavior, reducing the number of entries and time spent in the upper region of the apparatus. In the LDT, exposure to 3.0 mg/L also affected behavior, increasing time spent and the number of entries in the light region of the apparatus. Together, these data suggest that 2,4-D exerts toxic effects on zebrafish, particularly at a concentration of 3.0 mg/L. Exposure of zebrafish to environmentally relevant and higher concentrations of 2,4-D caused alterations in the gills and brain. However, the gills appear to be more sensitive organs to 2,4-D, likely due to direct contact with the contaminated environment. Our results provide scientific evidence supporting the need to review permissible exposure limits for 2,4-D in Brazil.