Avaliação dos efeitos farmacológicos de ML385: a inibição da via NRF2/KEAP1 e suas consequências

Abstract

O câncer de pulmão é um dos tipos de tumor mais epidemiologicamente relevantes atualmente, sendo a segunda maior causa de mortalidade global. O câncer de pulmão engloba dois tipos: o Carcinoma de Células Pequenas e o Carcinoma de Células Não-pequenas. O principal fator determinante do prognóstico tumoral são as mutações, que são os principais definidores da progressão e tratamento da doença. Dentre essas mutações, no Carcinoma de Células Não-pequenas se destaca a mutação na via NRF2/KEAP1, uma das principais vias do sistema antioxidante, reguladora de proteínas com essa função, protegendo as células de danos oxidativos. Algumas mutações específicas possuem tratamento-alvo específico e alguns tipos de tumor também podem ser tratados com imunoterapia. Os tumores que não possuem terapia específica são tratados com remoção cirúrgica quando possível, e com quimioterapia clássica. Os tumores mutantes em NRF2/KEAP1 não possuem tratamento-alvo, e possuem um mau prognóstico quando comparado aos outros tipos de câncer. Há pouco tempo, descobriu-se drogas capazes de inibir especificamente essa via, como o ML385. Foi demonstrado na literatura que esse composto era capaz de inibir o NRF2 de forma seletiva, demonstrando um efeito antitumoral, mas sem definir quais mecanismos dessa via envolvidos nesse processo. O foco desse estudo foi explorar esses mecanismos antitumorais in vitro derivados da inibição pelo ML385 em células de câncer de pulmão A549 com mutação de perda de função em KEAP1. A droga apresentou um efeito na diminuição de densidade celular promissor em tratamento de 6 dias de duração, em todas as concentrações testadas, mas não apresentou alterações morfológicas características de morte celular. Ainda, no ensaio de formação de colônias, a droga foi capaz de reduzir o número de células por colônias, apesar de não reduzir o número total de colônias. Foram explorados possíveis mecanismos de morte e ciclo celular, avaliando apoptose e autofagia, através da avaliação de caspase-3 e LC3 A/B I/II, e a droga não alterou a concentração total dessas proteínas, e não foi capaz de parar o ciclo celular em nenhuma das suas fases. Ainda se avaliou a produção de ERO e de GSH, da qual o ML385 aumentou a produção de ERO, e diminuiu a concentração de GSH, demonstrando que o efeito de inibição de NRF2 estava presente. Os achados nesse trabalho sugerem que apoptose, autofagia e alterações no ciclo celular não são os mecanismos responsáveis pelo efeito antitumoral, sendo possível que outros mecanismos como ferroptose e senescência sejam os responsáveis, sendo necessária a avaliação de mecanismos, bem como de outras estratégias terapêuticas.

Abstract: Lung cancer is one of the most epidemiologically significant types of tumors today, being the second leading cause of global mortality. Lung cancer includes two types: Small Cell Carcinoma and Non-Small Cell Carcinoma. The main determinant factor of tumor prognosis is mutations, which are the primary definers of disease progression and treatment. Among these mutations, in Non-Small Cell Carcinoma, the mutation in the NRF2/KEAP pathway stands out. This pathway is one of the main antioxidant systems, regulating proteins with this function and protecting cells from oxidative damage. Some specific mutations have specific targeted therapies, and some types of tumors can also be treated with immunotherapy. Tumors that do not have specific therapy are treated with surgical removal when possible, and with classical chemotherapy. Tumors with NRF2/KEAP1 mutations do not have targeted therapy and have a worse prognosis compared to other types of cancer. Recently, drugs capable of specifically inhibiting this pathway, such as ML385, have been discovered. Literature has shown that this compound can selectively inhibit NRF2, demonstrating an antitumor effect, but without defining the mechanisms involved in this process. The focus of this study was to explore these antitumor mechanisms in vitro of ML385 in A549 lung cancer cells with loss-of-function mutation in KEAP1. The drug showed a promising effect in reducing cell density with a 6-day treatment duration at all tested concentrations but did not show morphological changes characteristic of cell death. Additionally, in the colony formation assay, the drug was able to reduce the number of cells per colony, although it did not reduce the total number of colonies. Possible mechanisms of death and cell cycle were explored, evaluating apoptosis and autophagy through the assessment of caspase-3 and LC3 A/B I/II. The drug did not alter the total concentration of these proteins and was not able to stop the cell cycle in any of its phases. Furthermore, the production of ROS and GSH was evaluated, and ML385 increased ROS production and decreased GSH concentration, demonstrating that the NRF2 inhibition effect was present. The findings in this work suggest that apoptosis, autophagy, and cell cycle alterations are not the mechanisms responsible for the antitumor effect, and it is possible that other mechanisms such as ferroptosis and senescence are responsible, requiring further evaluation of these mechanisms as well as other therapeutic strategies.