Caracterização funcional do miR-200c-3p e miR-144-3p e validação de alvos moleculares em linhagem celular de câncer de mama triplo-negativo

Abstract

Entre todas as formas de câncer, exceto pele não-melanoma, o câncer de mama é o segundo mais incidente em mulheres em nível mundial. O subtipo triplo-negativo (TNBC) da doença, apesar de ser diagnosticado com menor frequência, é conhecido pelo prognóstico desfavorável e escassez de tratamentos eficazes. Nesse sentido, microRNAs (miRNA) consistem em sequências nucleotídicas endógenas curtas, capazes de modular a expressão gênica em nível pós-transcricional. Essas moléculas fazem parte da regulação de distintos processos celulares, como: crescimento, proliferação, autofagia, apoptose, entre outros; e tem apresentado relevância no desenvolvimento de novas terapias, já havendo estudos que demonstram a aplicação desta abordagem no tratamento de diversas formas de câncer. Com base nesse pretexto, um sistema de modelagem matemático foi previamente elaborado por nosso grupo de pesquisa, visando prever a atividade de moléculas de miRNA com expressão desregulada no TNBC nos processos de apoptose, autofagia e crescimento celular. Os miRNA miR-200c-3p e miR-144-3p tratam-se de importantes supressores tumorais no microambiente dessa forma de câncer de mama, ambos apresentando-se com expressão reduzida. O modelo matemático mencionado indicou que essas pequenas moléculas de RNA seriam capazes de atuar principalmente a partir de promoção da apoptose. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo a validação experimental dos resultados obtidos in silico a partir do aumento ou diminuição do conteúdo dos miRNA selecionados, além da otimização da rede regulatório aplicada no modelo. Para este fim, a linhagem proveniente de TNBC, MDA-MB-231, foi submetida ao processo de transfecção de moléculas mimics ou inibidores de cada miRNA. Posteriormente, distintos ensaios foram realizados para a determinação de viabilidade e morte celular, além da avaliação de expressão de genes e proteínas sob modulação dos respectivos miRNA. O aumento da concentração de cada miRNA no microambiente tumoral foi realizado de forma isolada, demonstrando capacidade de indução de apoptose, conforme indicado previamente pelo modelo. Neste contexto, a transfecção do mimic do miR-200c-3p promoveu morte celular por apoptose, principalmente a partir do aumento de expressão dos genes BAX e CASP3, além da redução de expressão dos alvos AKT3 e PI3K, da via de crescimento celular. O miR-144-3p também promoveu essa forma de morte, conforme indicado pela presença de exposição de resíduos fosfatidilserina (PS) e picnose nuclear. Embora o mecanismo exato pelo qual isso ocorreu ainda não tenha sido completamente elucidado, a apoptose parece estar associada à redução de expressão de alvos promotores tumorais como CFLAR, EGFR e IRS1. Adicionalmente, foi observado um fino balanço na regulação dos miR -200c-3p e -144-3p na linhagem celular MDA-MB-231, em que a redução da expressão desses miRNA, além do observado naturalmente no câncer de mama triplo-negativo, foi capaz de promover morte apoptótica. Nesse caso, a apoptose ocorreu possivelmente por meio de ativação excessiva de componentes da via de crescimento celular, como AKT3 e EGFR, para os inibidores de miR-200c-3p e miR-144-3p, respectivamente. Em conclusão, os miR-200c-3p e miR-144-3p parecem tratar-se de importantes supressores tumorais no TNBC, sendo o aumento da expressão desses ácidos nucleicos capaz de promover morte celular por apoptose. Ainda, a redução da expressão de ambos os miRNA acima de um certo limiar parece estar relacionada à superativação de respostas oncogênicas que culminam em perda de viabilidade a partir da indução de estresse celular.

Abstract: Breast cancer, excluding non-melanoma skin cancer, is the second most common cancer among women worldwide. The triple-negative subtype (TNBC) of the disease, although less frequently diagnosed, is known for its poor prognosis and the lack of effective treatments. In this context, microRNAs (miRNA) are short endogenous nucleotide sequences capable of modulating gene expression at the post-transcriptional level. These molecules are responsible for regulating various cellular processes, such as growth, proliferation, autophagy, apoptosis, among others, and have shown significant relevance in the development of new therapies. Studies have already demonstrated the application of this approach in treating various forms of cancer. Based on this premise, a mathematical modeling system was previously developed by our research group to predict the activity of miRNA with dysregulated expression in TNBC in the processes of apoptosis, autophagy, and cell growth. MiR-200c-3p and miR-144-3p are tumor-suppressor microRNAs downregulated in TNBC. The aforementioned mathematical model suggested that these small RNAs could primarily function by promoting apoptosis. In this context, the objective of this study was to experimentally validate the predictions made by the mathematical model regarding the impact of miRNA upregulation or downregulation on apoptosis, autophagy and cellular growth. Additionally, we sought to optimize the regulatory network within the model to enhance its accuracy and predictive power. To experimentally validate the in silico findings, the TNBC cell line MDA-MB-231 was transfected with miR-200c-3p and miR-144-3p mimics and inhibitors. Subsequent assays assessed cell viability, cell death, and gene/protein expression modulation by the respective miRNA. To assess the individual impact of each miRNA, the cellular content of miR-200c-3p and miR-144-3p were independently increased. Consistent with the mathematical model, miR-200c-3p induced apoptosis. According to experimental results, this regulation was primarily via BAX and CASP3 upregulation, simultaneously to the downregulation of cell survival genes as AKT3 and PI3K. MiR-144-3p also promoted apoptosis, as characterized by phosphatidylserine exposure and nuclear pyknosis. This effect was potentially induced by the downregulation of the oncogenes CFLAR, EGFR, and IRS1. However, the precise mechanism underlying miR-144-3p-induced apoptosis requires further investigation. Additionally, a delicate balance in the regulation of these miRNA was observed in the MDA-MB-231 cell line, where the further reduction in the expression of these miRNA, beyond what is naturally observed in TNBC, was capable of inducing apoptotic cell death. This likely occurred through the excessive activation of components in the cell growth pathway, such as AKT3 and EGFR, for miR-200c-3p and miR-144-3p inhibitors, respectively. In conclusion, miR-200c-3p and miR-144-3p appear to be significant tumor suppressors in TNBC, and an increase in the concentration of these nucleic acids is capable of inducing apoptotic cell death. Additionally, the reduction in the expression of these miRNAs beyond a certain threshold seems to be associated with the overactivation of oncogenic responses, leading to a loss of cell viability due to an increase in the activation of cellular stress responses.