Análise do fenômeno de variação de presença/ausência de genes codificantes de big defensinas em ostras Magallana gigas cultivadas em Florianópolis/SC

Abstract

As big defensinas são peptídeos antimicrobianos (AMPs) encontrados em moluscos, caracterizados por uma região N-terminal hidrofóbica e uma região C-terminal com seis resíduos conservados de cisteína, semelhantes às β-defensinas de vertebrados. Na ostra-do-Pacífico Magallana gigas, as big defensinas constituem uma família diversificada de AMPs, composta por diferentes membros (Cg-BigDef1 a Cg- BigDef7) que são codificados por genes distintos e expressos nos hemócitos, as células do sistema imune. Análises moleculares revelaram que indivíduos de uma mesma população não apresentam simultaneamente todos os genes Cg-bigdef, mas sim combinações variadas desses genes. Esse fenômeno, conhecido como variação de presença/ausência de genes (gene presence/absence variation ou PAV), foi descrito para os genes Cg-bigdef1, Cg-bigdef2 e Cg-bigdef3 em populações de M. gigas da França. Até o momento, ainda não se sabe se o fenômeno de PAV ocorre em outras populações de ostras ou se afeta também os demais genes Cg-bigdef. O objetivo deste trabalho foi verificar a presença dos genes Cg-bigdef1 a Cg-bigdef4 em diferentes lotes de ostras M. gigas cultivadas na cidade de Florianópolis/SC. Para as análises, foram coletadas amostras de brânquias de ostras de sete lotes, totalizando 20 animais, cultivados em Florianópolis/SC: #290, #291, #292, #293, #294, #296 e #297. O DNA genômico (gDNA) das brânquias foi extraído pelo método de acetato de potássio, seguido por tratamento com RNAse A. A qualidade da extração foi verificada em gel de agarose (0,8%) e pela amplificação do gene Cg- β-actin por PCR convencional. A verificação da presença dos genes Cg-bigdef1 a Cg-bigdef4 foi realizada por PCR quantitativa em tempo real (qPCR), utilizando-se iniciadores específicos. Como controle, foi verificada a presença de um gene associado ao metabolismo celular básico e que não é acometido pelo fenômeno de PAV, o fator de elongação 1-α (Cg-ef1α). Os resultados de qPCR mostraram que os genes Cg-bigdef1/2 estavam presentes em 60% dos indivíduos, enquanto Cg- bigdef3 foi detectado em 50% e Cg-bigdef4 em 65% das amostras. Somente 5% dos indivíduos apresentaram todos os genes. Todos os indivíduos do lote #296 foram positivos para o gene Cg-bigdef3, mas não para Cg-bigdef1/2 e apenas um indivíduo para a Cg-bigdef4. Interessantemente, todos os lotes apresentam ao menos um ou dois genes de big defensinas analisadas. O fenômeno de PAV afeta os genes Cg- bigdef1 a Cg-bigdef4 de M. gigas cultivadas no Brasil, no entanto ainda é necessário verificar a ocorrência desse fenômeno para os genes das demais big defensinas.

Big defensins are antimicrobial peptides (AMPs) found in mollusks, characterized by a hydrophobic N-terminal region and a C-terminal region with six conserved cysteine residues, similar to vertebrate β-defensins. In the Pacific oyster Magallana gigas, big defensins form a diverse family of AMPs, comprising different members (Cg-BigDef1 to Cg-BigDef7) encoded by distinct genes and expressed in hemocytes, the immune cells. Molecular analyses have shown that individuals within a same population do not simultaneously possess all Cg-bigdef genes but exhibit varying combinations. This phenomenon, known as gene presence/absence variation (PAV), has been described for the genes Cg-bigdef1, Cg-bigdef2 and Cg-bigdef3 in M. gigas populations from France. However, it remains unknown whether PAV occurs in other oyster populations or affects the other Cg-bigdef genes. This study aimed to investigate the presence of Cg-bigdef1 to Cg-bigdef4 genes in different batches of M. gigas oysters cultivated in Florianópolis/SC. Gill samples were collected from seven cultivation batches (#290, #291, #292, #293, #294, #296, and #297), totaling 20 animals Genomic DNA (gDNA) was extracted using the potassium acetate method, followed by RNAse A treatment. The quality of the extraction was verified by agarose gel electrophoresis (0.8%) and by amplifying the Cg-β-actin gene via conventional PCR. The presence of Cg-bigdef1 to Cg-bigdef4 genes was assessed through quantitative real-time PCR (qPCR) using specific primers. As a control, the elongation factor 1-α (Cg-ef1α) gene, which is associated with basic cellular metabolism and is not affected by PAV, was analyzed. Quantitative PCR results showed that Cg-bigdef1/2 genes were present in 60% of individuals, Cg-bigdef3 in 50%, and Cg-bigdef4 in 65% of the samples. Only 5% of individuals exhibited all genes. All individuals from batch #296 were positive for the Cg-bigdef3 gene but negative for Cg-bigdef1/2, with only one individual testing positive for Cg-bigdef4. Interestingly, all batches contained at least one or two of the analyzed big defensin genes. The PAV phenomenon affects Cg-bigdef1 to Cg-bigdef4 in M. gigas cultivated in Brazil. Further studies are needed to determine whether PAV also occurs in the other big defensin genes of M. gigas.